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特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种病因不明,以弥漫性肺泡炎,肺间质纤维化为特征的疾病,其发病率逐年升高,治疗效果差。特发性肺纤维化发生的分子机制尚不明确,也无有效的治疗手段。MicroRNA(miRNA)作为一种小RNA分子在许多生理过程中起着至关重要的作用,包括:组织发育和分化,细胞增殖及组织修复。随着miRNA在纤维化疾病中的研究越来越深入,应用miRNA调控技术治疗特发性肺纤维化引起了许多学者的关注。研究表明,多种miRNA参与调控细胞的分化,且在特发性肺纤维化发生发展中起着重要的作用。本实验室前期通过miRNA高通量芯片技术筛选出了肺内源性间充质干细胞向成纤维细胞分化过程中miRNA的差异表达谱。我们根据芯片结果分析以及数据库查阅发现,miR-497与RECK之间存在着潜在的负调控机制。因此,在本课题中,我们探讨了 miR-497诱导LR-MSCs分化的作用机制,并利用基因转染技术调控LR-MSCs中miR-497的表达,以探究其对LR-MSCs分化的影响。同时,在小鼠肺纤维化模型中,通过外源性调控miR-497的表达,研究其对纤维化发生的影响以及作用机制。全文分为两部分:第一部分miR-497对LR-MSCs分化的影响及作用机制探讨一、目的确认miR-497与RECK之间的靶向关系,并探讨miR-497在LR-MSCs向成纤维细胞分化过程中所起的作用及分子机制。二、方法1、293T细胞共转染miR-497上调病毒以及含有RECK序列的双荧光素酶质粒,48h之后,检测各分组荧光素酶活性情况。2、LR-MSCs分别转染miR-497上调或下调病毒,并与TGF-β1共培养7天,观察LR-MSCs分化情况。3、通过 RT-PCR 检测 miR-497、RECK、α-SMA、Collagen 表达水平。4、通过 Western blot 检测 RECK、α-SMA、Collagen、fibronectin、MMP-9、TGF-β1、vimentin蛋白表达水平。5、通过免疫荧光检测α-SMA、Collagen表达水平。三、结果1、在LR-MSCs向成纤维细胞分化过程中,miR-497显著性高表达。2、miR-497可以靶向性地结合RECK的3’UTR端,调控RECK的转录与蛋白表达。3、RT-PCR、Western blot及免疫荧光结果表明,上调miR-497的表达能够导致RECK表达下降,MMP-2/9、TGF-β1以及α-SMA、Collage等纤维化相关蛋白表达上调;相反,下调miR-497的表达时,RECK表达上升,MMP-2/9、TGF-β1以及α-SMA、Collage等纤维化相关蛋白表达下降,提示抑制miR-497可减弱TGF-β1诱导LR-MSCs向成纤维细胞的显型。4、在小鼠肺纤维化模型中,miR-497表达明显上调,其靶基因RECK表达显著下降。四、结论通过体内外实验证实,在LR-MSCs向成纤维细胞分化及小鼠肺纤维化模型的肺组织中,miR-497显著性上升。高表达的miR-497通过靶向性抑制RECK表达,导致金属基质蛋白激酶表达上调,激活并释放活化的TGF-β1,进而导致LR-MSCs向成纤维细胞分化。同时,我们证明了体外调节miR-497的表达可以有效地控制LR-MSCs向成纤维细胞分化。第二部分miR-497对小鼠肺纤维化发生发展的影响及作用机制探讨一、目的建立小鼠肺纤维化模型,探究miR-497在肺纤维化发生过程中所起的作用,并阐明其分子机制。二、方法1、C57BL/6J小鼠气管雾化给予miR-497调控病毒,7天后,各分组相应给予博来霉素或生理盐水,造模21天后,取肺组织检测相应指标。2、HE和马松染色检测肺组织结构变化及胶原沉积情况。3、RT-PCR 检测肺组织中 miR-497、RECK、α-SMA、Collagen 的表达水平。4、Western blot 检测肺组织中 RECK、α-SMA、Collagen、MMP-9、MMP-2 和TGF-β1蛋白表达水平。5、免疫荧光检测α-SMA、Collagen的表达情况。6、免疫组化检测α-SMA、MMP-2、MMP-9的表达,以及肺间质干细胞标记蛋白ABCG-2的表达情况。三、结果1、HE和马松染色结果表明,上调miR-497可以导致肺泡结构紊乱,胶原沉积增多,促进肺纤维化的形成。相反,抑制miR-497的表达能有效地修复博来霉素引起的肺损伤,促进肺泡上皮结构修复,减弱胶原蛋白沉积。2、RT-PCR检测发现,上调miR-497能够导致RECK表达下降,α-SMA、Collagen表达上升。当抑制miR-497的表达之后,RECK表达上调,α-SMA、Collagen的表达下调。3、免疫荧光检测发现,上调miR-497能够诱导纤维化标记蛋白α-SMA、Collagen表达上升,抑制miR-497的表达可以抑制α-SMA、Collagen的表达的升高,提示抑制miR-497可有效地减弱博来霉素的促纤维化作用。4、Western blot和免疫组化检测也证明了这一发现,上调miR-497能够促进α-SMA和Collagen纤维化标记蛋白的表达,并导致RECK表达下调,MMP-2/9和TGF-β1的表达水平上升。相反,抑制miR-497的表达则可有效地逆转这一过程,提示miR-497可抑制BLM诱导肺纤维化的显型。5、免疫组化检测发现,上调miR-497能够导致肺间质干细胞标记蛋白ABCG-2表达下降。相反,抑制miR-497可有效的维持肺间质干细胞原有的表型。四、结论在肺纤维化发生发展过程中,上调miR-497具有促进纤维化发生的作用,其通过抑制RECK的表达,导致金属基质蛋白激酶合成增多,降解细胞外基质,激活并释放活化的TGF-β1,最终促进纤维的发生发展。而抑制miR-497的表达可维持肺间质干细胞的表型,抑制其向成纤维细胞分化,促进肺泡结构修复,有效地抑制肺纤维化的发生发展。