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植物激素及其合成前体影响植物的生长发育及其对环境的适应性,对农作物的产量和品质起着至关重要的调控作用。多年来对植物激素的合成代谢及信号转导的研究,为植物遗传改良和育种提供了丰富的理论源泉,并对作物产量的提高起了革命性的推动作用。
本文克隆了小麦TaFACKEL、TaBRI1和TaGID1基因,并通过转化酵母和拟南芥及酵母双杂交等方法鉴定了基因的功能,对这些基因在不同时期部位和不同激素及光处理条件下的表达进行了分析。主要研究结果如下:
1.小麦TaFACKEL基因的克隆及功能分析
在小麦中克隆了TaFACKEL基因,开放阅读框(ORF)全长1122bp,编码373个氨基酸。系统进化树分析表明,TaFACKEL与拟南芥甾醇合成过程中的C-14还原酶具有最近的亲缘关系。酵母互补实验表明,TaFACKEL能够互补酵母突变体erg24生长缺陷的表型。酵母突变体转化株甾醇提取物紫外吸收峰的测定结果表明过量表达了TaFACKEL、ERG24和AtFACKEL的erg24突变体中都合成了麦角固醇,说明三者均有甾醇C-14还原酶的活性。用Real-time PCR方法对小麦不同时期部位和不同激素处理后的表达模式分析结果表明,TaFACKEL在五叶一心期的叶中表达量最高,雌蕊和生长10天的整株幼苗中次之;赤霉素抑制剂处理后表达量增加,油菜素内酯处理后表达量降低。Southern结果表明,在小麦基因组中可能至少存在3-6个TaFACKEL的基因拷贝。克隆得到的3个TaFACKEL基因组DNA序列,均由11个内含子和12个外显子组成,序列差异主要在内含子区。利用中国春小麦的缺体四体进行染色体定位结果表明,这三个基因拷贝分别位于小麦的1A、1B和1D染色体上,命名为TaFACKELa、TaFACKELb和TaFACKELd。分别在小麦近缘种乌拉尔图小麦(Triticum urartu)、拟斯卑尔脱山羊草(Aegilops speltoides)、粗山羊草(Aegilops tauschii)和硬粒小麦(Triticum durum)中克隆到了FACKEL的同源基因,命名为TuFACKEL,AesFACKEL,AetFACKEL,TdFACKEL1和TdFACKEL2,系统进化树分析结果表明,普通小麦的TaFACKELa与硬粒小麦的TdFACKEL1亲缘关系最近,然后与乌拉尔吐小麦的TuFACKEL聚在一支;普通小麦的TaFACKELb与硬粒小麦的TdFACKEL2亲缘关系最近,然后与拟斯卑尔脱山羊草的AesFACKEL聚在一支;普通小麦的TaFACKELd与粗山羊草的AetFACKEL聚在了一支;此结果符合并进一步证实了普通小麦染色体组的起源。我们还发现TaFACKEL基因在小麦中存在着可变剪切现象,进一步分析表明,FACEKEL基因在植物中可能普遍存在可变剪切现象,其中只有一种剪切方式能产生完整蛋白并具有甾醇C-14还原酶的功能,其他剪切体的具体功能还有待进一步研究。
2.小麦中可能的油菜素内酯受体TaBRI1基因的克隆与分析
在小麦和大麦中分别克隆了TaBRI1和HvBRI1,ORF分别为3375bp和3357bp,编码1125和1118个氨基酸。TaBRI1和HvBRI1序列相似性很高,都是富含亮氨酸重复的跨膜受体激酶蛋白。序列比对分析表明,BRI1蛋白在进化上是很保守的。系统进化树分析表明,其可分为两类:BRL蛋白和BRI1蛋白;小麦与大麦具有最近的亲缘关系。过量表达了TaBRI1-GFP融合蛋白的转基因拟南芥表明,TaBRI1是在细胞膜上表达的。用Real-time PCR方法对小麦不同时期部位和不同激素处理后的表达模式分析结果表明,TaBRI1在小麦的快速伸长的花丝中表达量最高,在雌蕊中的表达量也很高,都显著高于在其他部位的表达量,这说明TaBRI1可能在生殖器官的形成与发育中有较重要的作用;ABA处理幼苗4小时后,TaBRI1的表达量增加约1倍左右。与拟南芥bril-301突变体的互补试验结果表明,过量表达了TaBRI1的转基因植株不能互补拟南芥突变体的表型,说明可能TaBRI1的作用在拟南芥和小麦中有差别。利用病毒介导的基因沉默系统(VIGS)在小麦中研究TaBRI1的功能,虽然侵染成功,但带有TaBRI1目的片段的病毒侵染的转基因植株却没有明显的基因沉默表型。
3.小麦TaGID1基因的克隆与功能初步鉴定
在小麦中克隆了TaGID1,ORF全长1068bp,编码356个氨基酸,39bp和40bp之间具有一个624bp的内含子。系统进化树分析表明,GID1蛋白分为两类:单子叶植物和双子叶植物;小麦与大麦具有最近的亲缘关系;拟南芥的三个基因可能是分两支进化的。用Real-time PCR方法对小麦不同时期部位、不同激素和光处理后的表达模式分析结果表明,TaGID1在快速伸长的花丝中的表达量最高,其次是叶中,幼穗的表达量最低;快速伸长的花丝中的表达量是幼穗中表达量的100倍左右;TaGID1在赤霉素处理后表达量约下降为原来的1/3;暗中生长的幼苗见光2小时后TaGID1的表达量增加了5倍左右。酵母双杂交的结果表明,在活性赤霉素存在的情况下,TaGID1和OsSLR1可以在体外相互作用;没有赤霉素存在的情况下,TaGID1和OsSLR1不能相互作用;TaGID1在活性赤霉素存在的情况下与OsSLR1蛋白具有相互作用,初步证实了TaGID1具有赤霉素受体的功能。