小肠是人体重要的消化吸收器官，多种因素致小肠组织结构损伤和功能障碍等，小肠黏膜损伤修复的机制不明，因而在治疗上未能取得满意的效果。研究发现，小肠隐窝处存在着小肠上皮干细胞，它可以分化为吸收细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞、潘氏细胞等小肠上皮细胞，在上皮细胞正常的衰老死亡和病理损伤后，干细胞增殖、分化，在上皮修复过程中发挥主导作用。小肠上皮干细胞的增殖、分化行为受细胞基因及干细胞所处的微环境双重因素影响，生长因子、细胞因子和细胞基质分子形成的微环境提供了干细胞增殖与分化的必要的物质基础。TGF-a、EGF、FGF-2、HGF、IGF、KGF等细胞因子在体内外研究中均能促进肠上皮细胞的增殖。　　 新近的研究发现，小肠黏膜损伤后，除了小肠本身具有强大的自我更新及损伤修复能力外，一些肠外来源的细胞如骨髓的细胞等也参与了其中的调节。将骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植入器官损伤的动物体内，可见损伤的器官内有外源的细胞定植，MSCs可向多种组织器官迁移定位并分化为相应的组织细胞，参与损伤组织器官的修复。MSCs起源于中胚层，具有多向分化的潜能，MSCs可以分泌大量的促进细胞增殖分化的因子，如肝细胞生长因子、神经细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子等。目前，体内研究表明骨髓MSCs能向受损的小肠粘膜迁移、定植、分化，分泌细胞因子，促进隐窝再生，并与小肠上皮干细胞相互作用，加速受损粘膜修复。　　 本实验主要从体外研究MSCs对损伤小肠上皮细胞的修复作用。分为三部分。第一部分：采用全骨髓培养法体外培养扩增雄性SD大鼠的MSCs，为体外共培养研究做准备；第二部分：大鼠小肠隐窝上皮细胞株IEC-6的鉴定及体外放射损伤模型的建立：第三部分：利用Transwell间接接触共培养装置进行研究，观察MSCs对正常及放射损伤IEC-6的影响。　　 研究目的：　　 1、探讨通过全骨髓培养体外扩增培养大鼠MSCs的方法。　　 2、鉴定大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6，建立放射损伤IEC-6细胞模型。　　 3、观察体外培养骨髓间充质干细胞对正常及放射损伤小肠隐窝上皮细胞IEC-6凋亡与增殖的影响，探讨MSCs参与小肠隐窝上皮细胞损伤修复的作用机制，为MSCs治疗损伤小肠提供实验依据。　　 研究内容及方法：　　 1、全骨髓培养法分离大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)。　　 取3～4周龄雄性SD大鼠，冲出股骨及胫骨骨髓腔内细胞，吹打成单细胞悬液，离心收集细胞，用含10％胎牛血清的完全培养基培养并传代扩增。流式细胞仪检测荧光标记的表面标志CD29、CD44、CD34、CD45。　　 2、大鼠小肠隐窝上皮细胞株IEC-6的鉴定及放射损伤模型的建立。　　 应用免疫细胞化学双染色，鉴定IEC-6中肠干细胞蛋白水平的表达；行RT-PCR鉴定IEC-6中肠上皮细胞各基因RNA水平表达；分别给予IEC-6一次性8Gy、10Gy、12Gyβ射线，光镜下观察形态学变化，流式细胞仪检测凋亡率，选择合适剂量，建立放射损伤细胞模型，及观察时间，为MSCs修复提供实验基础。　　 3、共培养研究。　　 IEC-6种植于6孔transwell板下室，用10％FCS完全培养基培养融合至50％时，用1％FCS完全培养基同步诱导24小时，融合约70％，给予10Gyβ射线一次性照射，与种植在transwell上室中融合60％MSC及ASC共培养，共分5组，正常IEC-6组(IEC-6)，正常IEC-6与MSCs共培养组(IEC-6+MSCs)，放射损伤IEC-6组(IEC-6/R)，放射损伤IEC-6与MSCs共培养组(IEC-6/R+MSCs)，放射损伤IEC-6与对照ASC共培养(IEC-6/R+ASC)。1d、3d、5d、7d分别用流式细胞术(FCM)和Tunel法检测IEC-6凋亡率。FCM检测周期中S期细胞所占百分比，PCNA染色，细胞生长曲线行增殖检测，ELISA检测各培养组上清液中HGF、EGF、FGF-2的变化。　　 实验结果：　　 1、接种后2d后首次换液，贴壁细胞呈现多角形、梭形、纺锤形等，第10d逐步形成细胞克隆。12d～16d后细胞融合成单层，达80％～90％，传代后的细胞较原代贴壁、生长快速。随代数增加，细胞形态趋向均一，呈梭形为主，细胞克隆呈“漩涡状”。FCM检测结果显示细胞均一性好，阳性率：CD29 99.17±1.36％，CD44 98.24±1.01％，CD34 2.79±0.24％，CD45 1.69±0.19％。　　 2、IEC-6表达肠上皮干细胞基因Msi1、Hes1、Lgr5；短暂扩增细胞基因Cdx2；吸收细胞基因Si；潘式细胞基因Lyz1；杯状细胞基因TFF3；神经内分泌细胞基因ChgA。能较好的模拟体内小肠隐窝上皮细胞。　　 3、IEC-6放射损伤模型。　　 融合80％IEC-6，予10Gy放射损伤后第3d达凋亡高峰，凋亡率为37.9±3.26％，光镜下形态宽扁，细胞间隙变大，核皱缩、变圆、细胞膜棘突状，贴壁细胞脱落，漂浮细胞增多，之后进入修复期，7d基本恢复正常形态。　　 4、IEC-6与MSCs共培养。　　 (1)MSCs与正常IEC-6共培养7d，与正常IEC-6单独培养组相比，FCM检测各组IEC-6中细胞周期S期百分比、PCNA染色、细胞生长曲线均无统计学差异(P＞0.05)。　　 (2)与放射损伤IEC-6共培养，10 Gy放射后第3d IEC-6/R+MSCs中IEC-6 FCM和Tunel染色法凋亡率低于其余两个对照组(P＜0.05)，MSCs能减少IEC-6早期凋亡；5d、7d IEC-6/R+MSCs中IEC-6 PCNA染色百分比高于对照组(P＜0.05)，5dIEC-6/R+MSCs中IEC-6 S期百分比高于对照组(P＜0.05)，细胞生长曲线示IEC-6/R+MSCs组IEC-6细胞生长增殖高于对照组(P＜0.05)，MSCs能促进其增殖修复；ELISA示IEC-6/R+MSCs组上清液中EGF表达在3d、5d、7d高于对照组(P＜0.05)，IEC-6/R+MSCs上清液中HGF 1d、3d、5d、7d表达均高于对照组(P＜0.05)，FGF-2各组间表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 结论：　　 1、采用全骨髓培养法可以在体外获得较纯的大鼠MSCs。　　 2、IEC-6表达大鼠小肠隐窝上皮细胞相关基因Msi1、Hes1、Lgr5、Cdx2、Lyz1、Si、TFF3、ChgA。　　 3、经10Gyβ射线一次性体外照射后，IEC-6第3d凋亡达高峰，之后进入修复期，7d基本恢复正常。　　 4、MSCs对正常IEC-6无促增殖作用，但能减少放射损伤IEC-6凋亡，促进其增殖，其增殖修复作用可能与MSCs分泌HGF、EGF有关。