甾醇是广泛存在于自然界中的一类甾族化合物,是以环戊烷全氢菲为骨架带有4个环的高碳环形一元仲醇。根据其来源的不同,甾醇可分为动物甾醇、植物甾醇和菌类甾醇。植物油脱臭馏出物是植物油精炼过程中的一个副产品。植物油脱臭馏出物成分非常复杂,主要含有脂肪酸、植物甾醇、维生素E、甘油酯及其他组分。植物油脱臭馏出物是植物甾醇主要来源。本课题的目的是,微生物发酵植物油脱臭馏出物,通过菌体生长消耗其中的脂肪酸,实现植物甾醇的浓缩;同时,培养高菌类甾醇含量细胞。热带假丝酵母1253发酵花生油脱臭馏出物时,发酵培养基中脱臭馏出物添加量越大,热带假丝酵母生长越差,脂肪酸的消耗越低,这与溶氧不足有关。发酵培养基中脱臭馏出物的最适添加量为4.0%。无机氮源的发酵效果均优于有机氮源,且无机氮源中尿素的发酵效果最佳。Ca2+、Fe2+、Co2+、Mn2+、Zn2+明显地抑制了热带假丝酵母的生长,其中Ca2+的抑制作用最强,而Mg2+则可刺激热带假丝酵母的生长。脱臭馏出物发酵的最佳培养基为花生油脱臭馏出物4.0%、尿素浓度0.1%、硫酸镁添加量0.02%、磷酸氢二钾0.2%、磷酸二氢钾0.2%。脱臭馏出物的最佳发酵条件为初始pH6.0、接种量10%,发酵温度30℃,摇床转速200r/min、发酵时间120h。经过发酵后,获得菌体(湿重)6.38g/100mL,脱臭馏出物中游离脂肪酸由66.3%降低为13.37%,其消耗率达到79.84%,而脱臭馏出物中植物甾醇浓度由14.9%增加到了28.43%,实现了脱臭馏出物中植物甾醇的浓缩。热带假丝酵母1253发酵花生油脱臭馏出物时,发现所收获的酵母细胞含有很高的甾醇。因此,以获得高甾醇含量酵母细胞为目的,研究了其培养条件。发酵脱臭馏出物产生高甾醇含量细胞的原因是使用游离脂肪酸做碳源。无机氮源培养的菌体甾醇含量均高于有机氮源,其中以尿素作为氮源时菌体甾醇含量最高。Ca2+、Li+、Fe2+、Co2+、Zn2+明显地抑制菌体甾醇的合成,而Mg2+则对甾醇的合成有很大促进作用。高甾醇酵母细胞的最佳发酵培养基为花生油脱臭馏出物4.0%、尿素0.14%、硫酸镁0.01%、磷酸氢二钾0.2%、磷酸二氢钾0.2%。最佳发酵条件为初始pH7.0、接种量11%,发酵温度30℃,摇床转速200r/min、发酵时间98h。经过发酵后,获得菌体(湿重)6.01g/100mL,菌体甾醇含量为4.22%(湿重)。采用皂化-有机溶剂提取法进行了热带假丝酵母中甾醇的提取。湿菌体的甾醇提取率比干菌体的高11.19%,其原因是湿菌体更易破碎皂化。采用酸法、碱法、酶法、超声波破壁法、反复冻融法对菌体进行破壁处理,发现碱液法的破壁效果最好。碱液(氢氧化钠)处理既起到了破壁作用,又实现皂化反应。分别使用正己烷、正庚烷、环己烷、乙酸乙酯、石油醚、乙醚六种有机溶剂进行甾醇萃取,发现乙酸乙酯的提取率最高,62.98%。最佳的皂化剂是由20%NaOH:95%乙醇=5:3(V:V)混合而成。最佳的菌类甾醇提取工艺:将菌体与皂化剂比按1:50进行混合,80℃水浴皂化3.5 h;旋蒸除去乙醇,自然冷却至室温,加入乙酸乙酯,震荡萃取15 min,静置2h,得上清液,旋蒸蒸干,即为菌类甾醇粗提物,其总甾醇纯度为15.71%。造成菌类甾醇提取物纯度较低的原因是含有大量不明胶体物质。经过HPLC测定,菌类甾醇提取物中麦角甾醇含量仅为1.29%,这说明细胞中的主要甾醇不是麦角甾醇。该细胞中所含的甾醇种类及结构有待进一步研究。