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蜜环菌[Armillariamellea(Vahl. ex Fr.)Quel]又称榛蘑、小蜜环菌、栎菌，是白磨科的药食兼用菌，在亚洲传统饮食和医药中发挥着重要作用。倍半萜类化合物是蜜环菌的主要活性成分，具有多种生物活性。本论文对源于蜜环菌发酵液的原伊鲁烷型倍半萜芳香酯有效部位(Protoilludane sesquiterpenoid aromatic esters of A. mellea, PSAM)的含量测定方法及纯化工艺进行了研究，并依据前人关于蜜环菌乙酸乙酯部位抗炎抗氧化活性报道及课题组的预实验，探索了PSAM的抗抑郁和抗肝损伤药理活性和作用机制。主要研究内容和结果如下：
1、PSAM含量测定方法的建立和制备工艺研究
依据PSAM中原伊鲁烷型倍半萜芳香酯的特征结构单元——邻羟基苯甲酰基的紫外光谱特征，建立了PSAM含量测定的紫外分光光度法，并进行了方法学考察，建立的方法在精密度、稳定性、重复性和加样回收率等方面符合要求。在该含量测定方法的指导下，采用溶剂萃取法结合聚酰胺色谱法建立了PSAM的制备工艺，该有效部位原伊鲁烷型倍半萜芳香酯的含量以蜜环菌甲素计为54.5%。
2、PSAM抗抑郁活性实验研究
(1)联合给药实验：通过经典行为学绝望模型悬尾试验(TST)和强迫游泳试验(FST)筛选出PSAM的有效剂量和亚有效剂量；探究了抗抑郁药、拮抗剂和激动剂对PSAM抗抑郁活性的影响，并测定了小鼠脑海马区的5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NA)、多巴胺(DA)、γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)水平。结果表明，PSAM(腹腔注射，i.p.)的有效剂量和亚有效剂量分别为1mg/kg和0.1mg/kg；小鼠在TST中的活动比FST更敏感，因此选择TST作为后续实验模型。PSAM(0.1 mg/kg，i.p.)与亚有效剂量氟西汀和瑞波西汀联用，显著降低了TST中小鼠不动时间，表现出协同增效作用。PSAM(1 mg/kg，i.p.)的抗抑郁活性可以被氟哌啶醇(非选择性D2受体拮抗剂)、荷包牡丹碱(竞争性GABA拮抗剂)、NMDA(谷氨酸受体激动剂)预处理来逆转。同时，PSAM显著增加海马DA、GABA和Glu水平，表明PSAM的抗抑郁作用可能由DA、GABA和Glu能神经系统介导。
(2)PSAM对脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞(BV-2)炎症及小鼠抑郁的影响：BV-2细胞以不同浓度的蜜环菌甲素(armillarin，AR)和PSAM处理，检测细胞活力，并测定LPS诱导的BV-2细胞上清液一氧化氮(NO)以及白细胞介素(IL)-6和-1β、肿瘤坏死因子(TNF-α)的水平。LPS(0.5 mg/kg，i.p.)处理小鼠以建立抑郁模型，行为学试验后分离血清和海马组织，进行相关指标检测。结果表明：AR和PSAM对BV-2无细胞毒性，AR和PSAM预处理可以显著下调NO和各炎性细胞因子水平；PSAM在旷场试验(OFT)、高架十字迷宫试验(EPM)、TST和FST中均能改善LPS诱导的行为绝望症状，显著降低血清IL-6和TNF-α水平，同时改善超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的变化，并激活海马脑源性神经营养因子(BDNF)和酪氨酸激酶受体B(TrkB)的表达，抑制核因子κB抑制蛋白α(IκB-α)磷酸化的表达和核转录因子(NF-κB)向细胞核内的转运。综上，PSAM的抗抑郁作用与其抑制炎症、改善氧化应激和调节神经营养因子有关。
(3)PSAM对慢性不可预测应激(CUMS)诱导小鼠抑郁行为的影响：通过CUMS刺激诱导小鼠抑郁，行为学试验后分离血清、海马和下丘脑，并对相关指标进行检测。结果显示，PSAM治疗显著增加小鼠体重和SPT中蔗糖水摄入量，改善CUMS诱导小鼠OFT、EPM、TST和FST的抑郁行为；PSAM还降低了海马IL-6、IL-1β和TNF-α的水平，抑制了海马caspase-9和NLRP3的表达，降低了血清皮质酮(CORT)和促肾上腺皮质激素(ACTH)以及下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的水平，并激活海马BDNF、磷酸化-环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(p-CREB)和突触后密度蛋白95(PSD95)以及下丘脑谷胱甘肽还原酶(GR)的表达。综上，PSAM改善了CUMS诱导小鼠抑郁行为，与其抑制神经炎症、凋亡以及HPA轴亢进，改善突触的可塑性及其功能有关。
3、PSAM抗肝损伤活性实验研究
(1)PSAM对LPS诱导RAW264.7细胞炎症及LPS/D-GalN诱导小鼠爆发性肝损伤的影响：以不同浓度的AR和PSAM处理RAW264.7细胞，检测细胞活力，并测定LPS诱导的RAW264.7细胞上清NO以及IL-6、IL-1β、TNF-α的水平。LPS(50μg/kg，i.p.)和D-GalN(800 mg/kg，i.p.)处理小鼠以建立肝损伤模型。造模8小时后，分离肝组织和血清，进行相关指标测试。结果表明：AR和PSAM对RAW264.7无细胞毒性，AR和PSAM预处理显著下调NO和炎性细胞因子水平；PSAM显著地抑制了LPS/D-GalN诱导小鼠血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和肝脏MDA水平的升高，逆转肝脏SOD、谷胱甘肽(GSH)和过氧化氢酶(CAT)水平降低，下调血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平，并抑制NF-κBp65向细胞核内转运，激活转录因子NF-E2相关因子2(Nrf-2)和血红素加氧酶-1(HO-1)的表达。综上，PSAM表现出抗爆发性肝损伤作用，作用机理与其抑制炎症和氧化应激有关。
(2)PSAM对对乙酰氨基酚(APAP)诱导的药物性肝损伤和四氯化碳(CCl4)诱导化学性肝损伤的影响。结果表明，PSAM预处理不能显著抑制血清ALT和AST水平升高。因此，PSAM(7.5、30 mg/kg，i.p.)对APAP和CCl4诱导的肝损伤没有明显的保护作用。
1、PSAM含量测定方法的建立和制备工艺研究
依据PSAM中原伊鲁烷型倍半萜芳香酯的特征结构单元——邻羟基苯甲酰基的紫外光谱特征，建立了PSAM含量测定的紫外分光光度法，并进行了方法学考察，建立的方法在精密度、稳定性、重复性和加样回收率等方面符合要求。在该含量测定方法的指导下，采用溶剂萃取法结合聚酰胺色谱法建立了PSAM的制备工艺，该有效部位原伊鲁烷型倍半萜芳香酯的含量以蜜环菌甲素计为54.5%。
2、PSAM抗抑郁活性实验研究
(1)联合给药实验：通过经典行为学绝望模型悬尾试验(TST)和强迫游泳试验(FST)筛选出PSAM的有效剂量和亚有效剂量；探究了抗抑郁药、拮抗剂和激动剂对PSAM抗抑郁活性的影响，并测定了小鼠脑海马区的5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NA)、多巴胺(DA)、γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)水平。结果表明，PSAM(腹腔注射，i.p.)的有效剂量和亚有效剂量分别为1mg/kg和0.1mg/kg；小鼠在TST中的活动比FST更敏感，因此选择TST作为后续实验模型。PSAM(0.1 mg/kg，i.p.)与亚有效剂量氟西汀和瑞波西汀联用，显著降低了TST中小鼠不动时间，表现出协同增效作用。PSAM(1 mg/kg，i.p.)的抗抑郁活性可以被氟哌啶醇(非选择性D2受体拮抗剂)、荷包牡丹碱(竞争性GABA拮抗剂)、NMDA(谷氨酸受体激动剂)预处理来逆转。同时，PSAM显著增加海马DA、GABA和Glu水平，表明PSAM的抗抑郁作用可能由DA、GABA和Glu能神经系统介导。
(2)PSAM对脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞(BV-2)炎症及小鼠抑郁的影响：BV-2细胞以不同浓度的蜜环菌甲素(armillarin，AR)和PSAM处理，检测细胞活力，并测定LPS诱导的BV-2细胞上清液一氧化氮(NO)以及白细胞介素(IL)-6和-1β、肿瘤坏死因子(TNF-α)的水平。LPS(0.5 mg/kg，i.p.)处理小鼠以建立抑郁模型，行为学试验后分离血清和海马组织，进行相关指标检测。结果表明：AR和PSAM对BV-2无细胞毒性，AR和PSAM预处理可以显著下调NO和各炎性细胞因子水平；PSAM在旷场试验(OFT)、高架十字迷宫试验(EPM)、TST和FST中均能改善LPS诱导的行为绝望症状，显著降低血清IL-6和TNF-α水平，同时改善超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的变化，并激活海马脑源性神经营养因子(BDNF)和酪氨酸激酶受体B(TrkB)的表达，抑制核因子κB抑制蛋白α(IκB-α)磷酸化的表达和核转录因子(NF-κB)向细胞核内的转运。综上，PSAM的抗抑郁作用与其抑制炎症、改善氧化应激和调节神经营养因子有关。
(3)PSAM对慢性不可预测应激(CUMS)诱导小鼠抑郁行为的影响：通过CUMS刺激诱导小鼠抑郁，行为学试验后分离血清、海马和下丘脑，并对相关指标进行检测。结果显示，PSAM治疗显著增加小鼠体重和SPT中蔗糖水摄入量，改善CUMS诱导小鼠OFT、EPM、TST和FST的抑郁行为；PSAM还降低了海马IL-6、IL-1β和TNF-α的水平，抑制了海马caspase-9和NLRP3的表达，降低了血清皮质酮(CORT)和促肾上腺皮质激素(ACTH)以及下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的水平，并激活海马BDNF、磷酸化-环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(p-CREB)和突触后密度蛋白95(PSD95)以及下丘脑谷胱甘肽还原酶(GR)的表达。综上，PSAM改善了CUMS诱导小鼠抑郁行为，与其抑制神经炎症、凋亡以及HPA轴亢进，改善突触的可塑性及其功能有关。
3、PSAM抗肝损伤活性实验研究
(1)PSAM对LPS诱导RAW264.7细胞炎症及LPS/D-GalN诱导小鼠爆发性肝损伤的影响：以不同浓度的AR和PSAM处理RAW264.7细胞，检测细胞活力，并测定LPS诱导的RAW264.7细胞上清NO以及IL-6、IL-1β、TNF-α的水平。LPS(50μg/kg，i.p.)和D-GalN(800 mg/kg，i.p.)处理小鼠以建立肝损伤模型。造模8小时后，分离肝组织和血清，进行相关指标测试。结果表明：AR和PSAM对RAW264.7无细胞毒性，AR和PSAM预处理显著下调NO和炎性细胞因子水平；PSAM显著地抑制了LPS/D-GalN诱导小鼠血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和肝脏MDA水平的升高，逆转肝脏SOD、谷胱甘肽(GSH)和过氧化氢酶(CAT)水平降低，下调血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平，并抑制NF-κBp65向细胞核内转运，激活转录因子NF-E2相关因子2(Nrf-2)和血红素加氧酶-1(HO-1)的表达。综上，PSAM表现出抗爆发性肝损伤作用，作用机理与其抑制炎症和氧化应激有关。
(2)PSAM对对乙酰氨基酚(APAP)诱导的药物性肝损伤和四氯化碳(CCl4)诱导化学性肝损伤的影响。结果表明，PSAM预处理不能显著抑制血清ALT和AST水平升高。因此，PSAM(7.5、30 mg/kg，i.p.)对APAP和CCl4诱导的肝损伤没有明显的保护作用。