目的:肺癌是导致人类死亡最为常见的恶性肿瘤之一，尽管肺癌在早期诊断和治疗方面取得了重大进展，但肺癌的易转移性导致5年相对总生存率仍比较低。由于上皮间质转化(EMT)与癌细胞的侵袭和转移能力高度相关，使其在多种肿瘤中都有很重要的预后意义。虽然吸烟已被确认能够导致肺癌的发生，但香烟烟雾是如何引起细胞的恶性转变，尤其是表观遗传修饰所起的作用仍不清楚。本研究通过对染烟细胞进行miRNA和mRNA的高通量测序，结合生物信息学分析筛选出与吸烟和肺癌转移相关，且在染烟细胞中差异表达的miRNAs。通过数据库预测并筛选与转移相关的miRNAs靶基因，进一步探索miRNAs调控靶基因在吸烟所致肺癌中的功能以及与EMT过程相关的调控机制，为肺癌的发病机制研究及其精准治疗提供理论依据。
　　方法:(1)验证细胞恶性程度和EMT特性。通过软琼脂克隆形成实验和裸鼠成瘤实验验证本课题组前期构建的香烟烟雾长期染毒致细胞恶性转化模型的细胞恶性程度;Transwell细胞迁移实验和划痕实验研究细胞迁移能力的改变，分析EMT过程相关的E-钙粘蛋白(E-cadherin，CDH1)，N-钙粘蛋白(N-cadherin，CDH2)，基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase9，MMP9）和波形蛋白(Vimentin，VIM)等分子标志物表达变化。
　　(2)分析筛选出关键miRNAs及其靶基因并验证miRNAs的功能。对正常传代人支气管上皮细胞(BEAS-2B，2B)和染烟30代细胞(S30)提取总RNA进行rnRNA和miRNA高通量测序，分析差异表达基因（Different expressed genes，DEGs）和差异表达miRNAs，通过功能和通路富集研究DEGs可能影响的生物学功能及通路;筛选出关键miRNAs（miR-106b-5p/miR-93-5p，以下简称miR-106b/miR-93）在不同染烟代数的细胞和肺癌组织中进行表达验证;基于TCGA数据库中肺癌相关数据分析miR-106b/miR-93与吸烟史、转移以及其它临床信息之间的相关性;进一步通过转染miRNAs模拟物(mimics)和抑制物(inhibitors)的方法过表达和敲减miR-106b/miR-93，验证对其细胞迁移的影响;通过miRanda、miDB和miRTarBase三个数据库预测miR-106b/miR-93的靶基因，与DEGs取交集筛选出在S30细胞中显著下调的靶基因;利用TCGA数据库分析靶基因与相关临床信息的相关性，筛选出与肺癌转移相关的靶基因(SMAD7)用于进一步分析;通过qPCR和western blot验证靶基因在染烟细胞和肺癌组织中的表达。
　　(3)为了验证miR-106b/miR-93与靶基因之间的靶向关系，利用TCGA数据库分析了在肺癌中miR-106b/miR-93和SMAD7表达量的相关性，并且检测了转染细胞中的SMAD7以及TGF-βRI的表达改变;构建SMAD7野生型和突变型3UTR质粒，通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-106b/miR-93与靶基因之间的靶向关系;使用R语言“survminer”和“survival”包对基于KMplot数据库分析靶基因表达高低和是否吸烟与患者预后的关系;采用GSEA富集工具对TCGA数据库中肺腺癌和肺鳞癌mRNA表达数据进行SMAD7单基因富集分析，从而分析SMAD7可能影响的信号通路;通过western blot和免疫荧光实验验证TGF-βRI在不同染烟代数细胞中的表达差异。
　　结果:(1)与正常传代细胞(2B)相比，染烟30代细胞(S30)的软琼脂克隆形成率显著升高（t=-12.125，P＜0.001）;裸鼠成瘤实验表明S30细胞已经具有较强的致瘤性，并且transwell迁移实验和细胞划痕实验结果表明S30细胞的迁移能力明显增强;EMT相关上皮特性相关的CDH1基因mRNA和蛋白表达随着染烟代数的增加显著降低(F=24.604，P＜0.001)，而间质化特性指标CDH2、MMP9和VIM表达显著增加（F=9.926、23.258和48.098，均P＜0.01），表明在长期香烟烟雾暴露过程中，BEAS-2B的上皮间质转化逐渐增强。
　　(2)高通量测序得到755个差异表达基因(DEGs)和203个差异表达miRNAs，通过功能和通路富集发现DEGs显著富集在多条EMT相关功能和信号通路;筛选出miR-106b/miR-93，对miR-106b/miR-93过表达可使细胞迁移能力明显增强，CDH1显著降低(P＜0.05)，CDH2和MMP9显著增高(P＜0.05);而敲减miR-106b/miR-93可使细胞迁移能力明显降低，CDH1显著升高(P＜0.05)，CDH2和MMP9显著降低(P＜0.05)，显示miR-106b/miR-93可影响细胞迁移能力和上皮细胞间质转化;进一步生物信息学预测筛选出与肿瘤转移相关的miR-106b/miR-93靶基因SMAD7，检测其基因和蛋白表达显示SMAD7表达在染烟后期细胞（S20和S30）中显著降低(P＜0.05);肺癌组织中SMAD7mRNA表达水平亦显著低于癌旁正常组织(t=4.483，P=0.001)。表明miR-106b/miR-93与细胞恶性转化后的迁移能力及EMT增强相关，并获得其靶基因SMAD7。
　　(3)基于TCGA中的表达量数据进行相关性分析，结果表明肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌(LUSC)组织中miR-106b/miR-93和SMAD7的表达呈显著负相关(LUAD:r=-0.2027、-0.1708，均P＜0.001;LUSC:r=-0.2976、0.4036，均P＜0.001)。过表达miR-106b/miR-93后，细胞中SMAD7表达显著降低（t=17.162和7，677，P＜0.01和P=0.002），而敲减miR-106b/miR-93之后表达升高(t=-4.847和-12.139，P=0.04和0.007);荧光素酶报告基因实验表明转染miR-106b/miR-93模拟物之后SMAD7荧光素酶活性显著降低（t=27.614和20.712，均P＜0.01）;生存分析显示高表达SMAD7在不吸烟非小细胞肺癌患者中具有很好的预后（P＜0.0001）;GSEA富集分析表明SMAD7在肺腺癌中与TGF-β信号通路(NES=2.117，FDR q-value=0.007)和紧密连接(NES=1.935，FDR q-value=0.037)等信号通路显著相关，在肺鳞癌中与细胞黏附分子(NES=1.913，FDR q-value=0.050)与锚定粘附(NES=1.878，FDR q-value=0.063)等信号通路显著相关;TGF-βRI蛋白表达在不同代数染烟细胞中差异显著(F=15.385，P＜0.001)，在染烟后期细胞中显著上调(P＜0.01)。
　　结论:长期香烟烟雾暴露能够诱导BEAS-2B发生恶性转化，致瘤性、迁移能力和上皮间质转化(EMT)能力明显增强;筛选出的miR-106b/miR-93显示其在吸烟所致恶性转化细胞和肺癌组织中的表达显著增高而其靶基因SMAD7表达显著降低，且二者均与肿瘤的转移密切相关;进一步功能分析发现SMAD7高表达在不吸烟非小细胞肺癌患者中具有很好的预后，且与包括EMT在内的肿瘤发生发展相关多个信号通路显著相关。