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本文利用生物信息学手段找出了鱼腥蓝细菌PCC7120基因组中所有的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶和磷酸酶基因,对其结构和染色体上的遗传排列作了一定的分析。并对该细菌中部分与信号转导相关的基因进行中断,筛选得到突变体,并进行验证及初步表型分析。 1.鱼腥蓝细菌PCC7120基因组中丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶和磷酸酶基因的查找分析 经鱼腥蓝细菌PCC7120基因组的查找分析发现鱼腥蓝细菌PCC7120中共有52个丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶基因(STPK)和14个磷酸酶基因(PP)。按照STPKs结构的不同可划分为五个亚类:STK-Ⅰ亚类只含有一个催化区域;STK-Ⅱ亚类的C端含有WD40重复序列;STK-Ⅲ亚类的C端含有不同的调节区域;STK-Ⅳ亚类的催化区域位于C端,HSTK-Ⅰ亚类则既含有丝氨酸/苏氨酸激酶的催化区域,又含有组氨酸激酶催化区域。14个PPs共分为3族:属PP2C族的有8个,属PTP族的有3个,属PP1/2A/2B族的有3个。与单细胞集胞藻蓝细菌Synechocystis PCC6803基因组比较,只有11个基因可以在该基因组中找到相似的基因。经遗传排列分析发现,有12个基因在染色体上组成了6对基因簇(gene cluster)。 2.信号转导相关基因突变体的构建及表型分析 本研究全部通过插入失活获得突变体。首先将PCR扩增片段(~1.5kb)利用PstⅠ和XhoⅠ插入常规克隆载体pBluescriptSK,利用基因内部合适的酶切位点插入Sp/Sm抗性片段,再利用PstⅠ和XhoⅠ位点将已插入抗性基因的PCR片段,转入整合载体pRL271中获得体外基因中断,最后利用三亲本杂交获得体内突变。本研究共构建了91个体外基因中断结构,获得23个可能的单交换突变体,53个可能的双交换突变体,对所得的双交换突变体进行PCR验证发现有6个为野生型,4个为单交换突变体,其余43个均为真正的双交换突变体。将验证的真突变体在缺氮条件下观察其异型胞的发育以及生长状况,发现有2种突变体All2898-,All1731-在缺氮条件下不能生长也不产异型胞,另有3种突变体All4141-,All1171-,All4761-在缺氮条件下可以产生异型胞,但仍不能维持正常生长,这可能是异型胞的结构被破坏或是异形胞中的固氮酶失活。所有这些基因在异形胞的发育过程中起重要作用。