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目的:1.提高漏声表面波(Leaky Surface Acoustic Wave, LSAW)传感器在液相中检测生物分子的稳定性和准确性,实现多个样本同时快速检测,构建出一种更适合于液相生物学反应的倒插式LSAW传感器检测系统。2.利用新构建的LSAW传感器阵列检测仪快速检测各种人畜共患性病原体,以早期诊断人畜共患性病原体感染。3.建立一种方便快速、价格低廉的检测甲型H1N1流感病毒M2、NA基因单碱基突变的滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)技术,以指导临床合理用药。方法:一、新型倒插式液相LSAW传感器检测系统构建及病原体检测1.在前期构建的双通道延迟线LSAW传感器的基础上,设计倒插式LSAW传感器。以Y方向切割36°旋转、X方向传播的LiTaO3作为压电基底,采用双通道延迟线结构,在输入叉指换能器与输出叉指换能器及其引线区域设置SiO2防水隔离层,缩小传感器基片厚度和尺寸,使其能够竖直插入反应池内。2.采用医用聚丙烯材料制作固定大小的反应池。3.采用2×3阵列设计传感器阵列。4.以半导体制冷片加热制冷为原理,由电源、温控系统和加热制冷系统组成温控装置。5.由倒插式LSAW传感器、NI-PXI信号发生采集系统、温控装置、计算机和LabVIEW软件共同组成倒插式液相LSAW传感器检测系统。6.针对狂犬病毒、口蹄疫病毒、炭疽杆菌和猪链球菌分别设计特异性捕获DNA探针,利用LSAW传感器实时在线检测探针与病原体核酸靶序列杂交反应。二、RCA技术检测甲型H1N1流感病毒M2、NA基因单碱基突变1.以甲型H1N1流感病毒耐药相关基因M2基因和NA基因为研究对象,设计检测该基因突变位点的环化探针,环化探针通过与发生单碱基突变的基因特异性结合并被连接成闭合环状,进行滚环扩增后从而特异性地检测单碱基突变。2.讨论用于该检测的RCA技术的合适反应条件,通过对人工合成的野生型和突变型靶序列检测,确定该方法的特异性和灵敏度。3.最后通过对临床标本的检测及与测序结果比对,验证该方法的准确性。结果:1.成功构建出了倒插式液相LSAW传感器检测系统。倒插式LSAW传感器阵列检测仪体积小巧,外形美观。传感器基片装卸方便,中心频率为100MHz,工作温度范围(20~70)℃,精度达±0.5℃。2.所构建的倒插式LSAW传感器能够实时在线直接检测探针与各病原体核酸靶序列的杂交反应,液相中非常稳定,噪声值为0.005°。以1μm/L的探针浓度检测ng/μl水平的DNA靶序列分子相位变化0.01°以上,信噪比均大于2,杂交反应时间15~25min。3. RCA技术检测单碱基突变,采用热循环连接法和提高连接温度(65℃),保证了RCA检测的特异性。通过对含有不同浓度突变靶序列标本的检测确定了该方法能检测出最低1%含量的突变株。RCA技术对临床标本的检测结果与测序方法检测结果一致。结论:1.新构建的倒插式液相LSAW传感器检测系统,能够实时在线检测各人畜共患性病原体核酸杂交反应,传感器稳定性良好、特异性高、检测时间短,但传感器检测的灵敏度仍需提高。2.成功建立了检测甲型H1N1流感病毒M2、NA基因单碱基突变的RCA技术,该技术特异性和灵敏度均达到检测要求。