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当前HIV-1的治疗主要针对其生活史的各阶段,阻断其复制周期,然而并不能杀灭体内游离病毒颗粒以及与宿主靶细胞基因整合的潜伏病毒。目前已广泛应用的高效抗反转录病毒疗法(Highly active antiretroviral therapy,HAART)虽能够抑制患者体内病毒复制,甚至阻断病毒在个体间的传播,但HIV-1病毒潜伏库基本不受HAART药物影响,HAART治疗中断后患者体内病毒载量会迅速反弹。清除体内游离病毒粒子,缩小病毒潜伏库规模,实现对患者体内HIV-1的长久抑制,达到功能性治愈甚至彻底治愈是当前HIV-1治疗研究的热点。近年在长期慢性感染HIV-1的“精英控制者”体内分离得到了多种具有优异中和活性的广谱抗体。人源化小鼠以及灵长类动物模型的体内实验证实,被动输入的中和抗体对HIV-1病毒呈现出剂量相关的预防及保护功效,将保护性HIV-1抗体长期且稳定的导入HIV-1患者体内对实现HIV-1功能性治愈具有重要意义。在实验研究中我们实验室分离鉴定了具有自主知识产权的单克隆中和抗体Y498,我们将针对HIV-1包膜蛋白CD4结合区的中和抗体Y498、VRC01,针对包膜gp120 V3聚糖区的 10-1074,gp41 包膜外侧区(membrane proximal external region,MPER)的10E8以及针对CD4结合区与共受体CCR5区的双特异性抗体4Dm2m的抗体基因构建至8型腺相关病毒(adenovirus-associated virus,AAV)载体中,研究其在BALB/c小鼠体内介导表达HIV-1中和抗体的能力,探究该治疗策略的免疫治疗潜力。同时,本课题通过点突变实验,构建了与灵长类体内新生胎儿受体(neo-natal Fc receptor,FcRn)具有高亲和力的在Fc结构域M428L/N434S位点突变的上述抗体,以延长中和抗体在灵长类实验动物或者人体内的抗体半衰期,有助于重组AAV载体介导表达的抗体实现较长时间的体内循环并累积至更高浓度以获得更好的抗病毒治疗效果。我们选择了抗体中和活性高且抗体基因能被重组 AAV 载体正常表达的 AAV-VRC01,AAV-10E8 和 AAV-10-1074 用于 BALB/c小鼠体内实验,M428L/N434S位点突变的重组AAV-VRC01-LS,AAV-10-1074-LS用于恒河猴体内实验。在BALB/c小鼠实验中,AAV载体各以1.0× 1011,3.3 × 1010,1.1×1010vg三个剂量组肌肉注射小鼠。AAV载体介导的HIV-1中和抗体在小鼠体内持续表达了 56周,我们发现三个剂量组间,抗体表达量与AAV注射剂量呈正相关。高剂量组AAV-VRC01介导表达的VRC01在注射后第六周达到峰值浓度257.8μg/ml,中剂量组在第十二周达峰值浓度219.5μg/ml,低剂量组在第二十周达峰值浓度139.8μg/ml。AAV-10-1074在小鼠体内介导的抗体表达能力更强,血浆抗体浓度更高且在较长时间段内维持了高浓度抗体水平,高剂量注射组在第24周达到峰值浓度1478μg/ml,中剂量组在第10周达到峰值浓度1390.5μg/ml,低剂量组在第14周达峰值浓度133.8μg/ml。我们发现小鼠体内抗体在到达峰值后浓度逐渐下降,另外在AAV-VRC01低剂量注射组当中,部分小鼠体内抗体含量始终低于检测下限。基于假病毒的中和实验结果表明AAV-VRC01与AAV-10-1074注射组小鼠血浆对HIV-1的tier 2毒株JRFL展现了与血浆抗体浓度正相关的体外中和活性,这提示小鼠体内具有值得肯定的抗病毒能力。在建立SHIV-SF162P3感染的恒河猴体内,AAV-VRC01-LS与AAV-1074-LS也介导了较持久的抗体表达,恒河猴体内AAV介导表达的浓度逐渐升高的中和抗体抑制了HIV-1膜融合抑制剂LP-19停药后反弹的血浆SHIV病毒载量。其中AAV-VRC01-LS注射组内5只恒河猴中的3只,血浆病毒载量被抑制在检测限下,而AAV-10-1074-LS抑制了组内5只恒河猴中的1只血浆病毒载量低于检测限。另外我们发现在重组AAV肌肉注射后,猴体内存在较强的针对AAV8载体的体液免疫反应,这在一定程度上限制了 AAV载体介导人源抗体的免疫治疗效果。本课题结果说明,我们构建的重组AAV8载体功能活性良好,能够在实验动物体内介导持久的HIV-1中和抗体表达;恒河猴体内AAV介导表达的中和抗体有能力长时间抑制病毒复制并降低病毒载量,为实验对象提供有效的免疫治疗作用;另外宿主对外源AAV转基因载体的免疫排斥值得预防。本课题研究表明AAV载体介导的基于HIV-1中和抗体的基因治疗策略可成为HIV-1治疗的可选工具,这也为实现HIV-1功能性治愈提供了新的思路。