牙周炎是口腔疾病中的常见病之一,它的始动因素是由于龈下牙菌斑中特定的革兰阴性厌氧菌过度的繁殖。牙周炎的发生发展还和宿主的免疫反应强弱和遗传因素相关,这决定了牙周炎在某些特定人群的发病率会比较高。牙周炎的临床表现包括牙周支持组织的破坏,如牙周膜、牙龈上皮和牙槽骨。严重的牙周炎可以导致牙龈退缩、牙槽骨不可逆的吸收和牙齿松动、脱落。吸烟、某些药物、系统疾病和青春期、孕期荷尔蒙的改变都能够影响牙周炎的发展和转归。因此,对牙周炎的治疗和预防是一个复杂而长期的工作。牙龈卟啉单胞菌是牙周炎的主要致病菌,它是一组绝对厌氧的革兰阴性菌,在冻融的血琼脂培养基上生长可呈黑色菌落。牙龈卟啉单胞菌的脂多糖是导致牙周炎发展的重要毒力因子。脂多糖可以引发牙周组织局部的天然免疫细胞对其产生免疫应答,并分泌前列腺素酶和大量炎性细胞因子,趋化血液里的多形核中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞游走到牙周组织并引发一连串免疫反应。牙龈卟啉单胞菌的脂多糖能够特异性的识别toll样受体2和4,还有促进成骨细胞表达细胞核因子κB体活化因子配基(RANKL)、白细胞介素一1、白细胞介素一8,前列腺素酶E2和肿瘤坏死因子,这些物质都是破骨细胞活化和分化的激活物。牙周炎是个慢性的炎症性疾病,组织学切片表明牙周炎组织中存在大量Th1/Th2类免疫细胞及其细胞因子,相关的研究也证实牙周炎的持续性病变是由Thl类免疫细胞及其细胞因子引起的,进展期的损害是由Th2类免疫细胞及其细胞因子介导的。因此,控制Th1/Th2类细胞因子在牙周局部组织的表达是决定牙周炎转归的最根本的决定因素。天然植物提取物具有免疫调节的功能,以及它具有的无毒副作用,已经在临床得到广泛的应用。牙周病学也有不少关于天然中草药的有效成分用于治疗牙周炎的报道。姜黄素是从姜科姜黄属植物生姜、莪术、藏红花等的根茎中提取的一种天然的多酚类化合物。传统中医学认为姜黄素有抗炎、抗氧化、抗微生物的作用,这些特性已经为现代科学方法证实,除此之外,它还有抗风湿、护心、护肝,纠正低血糖症的功效。而且大量的实验证实姜黄素在治疗炎性疾病,如关节炎,胃肠炎,皮肤外伤等方面表现了良好的疗效。从病理学角度来讲,牙周炎也是一种慢性炎症,而姜黄素对牙周炎的抗炎效果的研究很少有报道,因此,本研究通过以下一些实验观察姜黄素是否对牙周炎有治疗作用。目的：1.培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7,观察牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激细胞引起的细胞因子TNF-α和IL-1p在基因和蛋白水平的变化。观察牙龈卟啉单胞菌脂多糖是否激活NF-κB信号通路的活性。2.培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7,检测姜黄素对小鼠巨噬细胞是否有细胞毒性、以及毒性大小与剂量的关系。观察姜黄素对牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激巨噬细胞细胞因子TNF-α和IL-1p分泌的影响,这种影响与姜黄素的剂量是否有相关性。观察姜黄素对牙龈卟啉单胞菌脂多糖激活的巨噬细胞NF-κB信号通路是否有影响。材料和方法：1.小鼠巨噬细胞系RAW264.7的复苏和培养。牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激巨噬细胞后,常规酚氯仿法提取细胞mRNA,逆转录试剂盒转录成cDNA,利用RT-PCR分析细胞因子表达水平；收集细胞培养上清,用ELISA方法检查的蛋白表达水平。NF-κB信号通路则用免疫荧光和荧光素酶实验来检测。2.姜黄素预处理巨噬细胞,再用牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激,然后提取细胞mRNA,用RT-PCR和ELISA检测基因和蛋白表达情况。用免疫荧光和荧光素酶实验检测NF-κB信号通路。结果：1. RT-PCR结果显示,对照组中RAW264.7细胞有少量TNF-α基因的表达,IL-1p基因则没有表达；实验组发现TNF-α和IL-1p基因表达均显著增高。酶联免疫吸附实验结果显示,RAW264.7细胞培养上清中TNF-a和IL-Iβ的表达和mRNA的表达水平呈一致性。免疫荧光的结果,未加牙龈卟啉单胞菌LPS刺激的对照组中p65仅集中在细胞的细胞质中, 1μM牙龈卟啉单胞菌LPS刺激的实验组中p65在细胞胞浆和胞核中均有表达。NF-κB的荧光素酶报告基因实验结果表明, 1μM州牙龈卟啉单胞菌LPS刺激的实验组中细胞裂解液里表达的荧光素酶强度是未加牙龈卟啉单胞菌LPS刺激的对照组的5倍。2.MTS细胞毒性实验结果显示5,10,20 and 30μmol/1姜黄素对RAW264.7细胞没有毒性反应。RT-PCR结果,对照组RAW264.7细胞有少量TNF-α基因的表达,IL-1p基因则没有表达；实验组发现TNF-α和IL-1β基因表达均显著增高。20μm和30μm姜黄素预处理的RAW264.7细胞,在牙龈卟啉单胞菌LPS刺激后,TNF-α和IL-1β基因表达量明显比没有姜黄素预处理的低；10μm姜黄素对牙龈卟啉单胞菌LPS诱导的TNF-α表达有轻微的抑制作用,对牙龈卟啉单胞菌LPS诱导的IL-1β基因表达没有影响。5μm姜黄素对牙龈卟啉单胞菌LPS诱导的TNF-α和IL-1β基因表达均没有影响。酶联免疫吸附实验结果显示,RAW264.7细胞培养上清中TNF-α和IL-1β的表达和mRNA的表达水平呈相同趋势。免疫荧光的结果,对照组中p65仅集中在RAW264.7细胞的细胞质中,实验组中p65在RAW264.7细胞胞浆和胞核中均有表达,p65在下发生了明显的核转位。30μM姜黄素预处理的RAW264.7细胞在牙龈卟啉单胞菌LPS刺激后,核转位现象有明显地抑制。NF-κB的荧光素酶报告基因实验结果,实验组中细胞裂解液里表达的荧光素酶强度是对照组的5倍。姜黄素预处理的RAW264.7细胞,在牙龈卟啉单胞菌LPS刺激后细胞裂解液里的荧光素酶强度比只加牙龈卟啉单胞菌LPS刺激组要低；5μm姜黄素对牙龈卟啉单胞菌LPS刺激引起的荧光素酶强度没有显著影响。结论：1.牙龈卟啉单胞菌LPS刺激小鼠巨噬细胞细胞因子TNF-α和IL-1p的表达,同时激活NF-κB信号通路。2.姜黄素抑制牙龈卟啉单胞菌LPS刺激小鼠巨噬细胞细胞因子TNF-α和IL-1β的表达,这种抑制作用是通过抑制NF-κB信号通路达到的。