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第一部分相对于竞争型免疫分析体系,非竞争型免疫分析方法具有操作简单、灵敏度高以及检测范围广等优点。然而,对于小分子物质而言,由于小分子物质的分子量及结合表位较小,难以直接被两个常规抗体同时结合,因此目前小分子物质的免疫分析体系大多以竞争型为主。本研究以食品中常见的真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)为小分子物质的研究模型,在形成DON抗原-抗体免疫复合物的基础上,投入天然噬菌体展示纳米抗体库,亲和淘选可特异性结合DON抗原-抗体复合物的噬菌体展示纳米抗体,经Phage-ELISA验证后,开展纳米抗体的可溶性原核表达,为建立基于纳米抗体的DON非竞争型免疫分析体系提供了一种新的途径和有效探索。本研究取得的主要实验结果如下:1.可特异性结合DON抗原-抗体免疫复合物纳米抗体的亲和淘选及鉴定以DON为研究对象,DON抗原-抗体免疫复合物作为靶标,经过四轮亲和淘选,从驼源天然噬菌体展示纳米抗体库中首次获得4种可特异性结合DON抗原-抗体免疫复合物的纳米抗体,经DNA测序分析后,分别命名为P-1、P-19、P-26、P-46,Phage-ELISA结果显示,上述纳米抗体对DON抗原-抗体复合物具有良好的结合特异性;建立了基于噬菌体展示纳米抗体(P-26)的非竞争型免疫分析DON曲线,结果显示:当DON标准品的浓度在0~500 ng/mL区间时,投入了所获噬菌体展示纳米抗体的对应板孔,其OD值随着加入的DON浓度增加而相应地提高,表明所获得的噬菌体展示纳米抗体对DON抗原-抗体复合物具有较好的结合响应度,但未呈现典型的线性曲线。2.可特异性结合DON抗原-抗体免疫复合物纳米抗体的原核表达通过分子克隆技术,提取P-1、P-19、P-26、P-46的VHH编码基因,将编码基因克隆至pET25b(+)原核表达载体上,经DNA测序验证,成功构建了重组表达载体pET25b-VHH-P-1、pET25b-VHH-P-19、pET25b-VHH-P-26和pET25b-VHH-P-46,并转化至E.coli Rosetta细胞;在1%葡萄糖,0.05 mM IPTG下诱导表达8 h,经镍柱纯化,并用50 Mm咪唑洗脱后,获得4种可溶性的纳米抗体N-1、N-19、N-26、N-46。建立了基于可溶性纳米抗体(N-26)的DON非竞争型免疫分析反应曲线,当DON标准品的浓度在8~100 ng/mL区间时,投入了纳米抗体的对应板孔,其OD值随着加入的DON浓度增加而相应地提高,表明所获得的可溶性纳米抗体对DON抗原-抗体复合物具有较好的结合响应度,为下一步开展DON的非竞争型免疫分析体系的建立提供了重要研究材料及有效地探索。第二部分Cry1Ac是一种常见的Bt(Bacillus thuringiensis,Bt)蛋白,现已广泛应用于抗虫转基因作物,比如大豆、棉花、水稻、小麦等。随着众多转基因农作物的逐渐商业化,市场上的转基因食品日益增多,同时转基因食品的安全性也逐渐受到大众的关注及重视,因此对食品中的转基因成分进行检测就显得十分重要。目前转基因成分(Genetically modified ingredients,GMO)的检测主要包括基于蛋白质检测的免疫分析以及基于核酸检测的PCR(Polymerase chain reaction,PCR)分析两大类。免疫分析具有特异性高、操作简单以及可高通量筛选等优点,然而由于其自身信号扩增体系的局限性,也存在着灵敏度不高、假阳性较多等缺陷。本研究在获得可特异性结合Cry1Ac蛋白的噬菌体展示纳米抗体的基础上,将免疫分析与核酸分析的技术优势进行综合,建立基于噬菌体DNA信号扩增体系的免疫PCR分析Cry1Ac蛋白方式,主要实验结果如下:1.针对抗Cry1Ac噬菌体展示纳米抗体编码基因的CDR3区设计了特异性的PCR扩增引物,成功地扩增了纳米抗体的CDR3区(98 bp),为噬菌体展示纳米抗体的特异性信号扩增奠定了基础。2.将抗Cry1Ac单克隆抗体(8A8)作为捕获抗体,抗Cry1Ac噬菌体展示纳米抗体(P-72)作为检测抗体,建立了转基因蛋白Bt-Cry1Ac的免疫PCR检测方法。该方法的拟合标准曲线结果显示,其线性相关系数为0.9968,线性范围为0.001~100 ng/mL,最低检测限为0.094 pg/mL;该方法对于Cry1Ac的同源蛋白Cry1Ab的交叉反应率为3.4%,对其它杂类蛋白质无交叉反应,具备良好的检测特异性;加标回收实验结果显示,该方法用于检测Bt-Cry1Ac的加标回收率为78.81~146%,变异系数CV(%)范围6.13~21.92,表明该方法具有较好的准确性及重现性。