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目的：
基于网络药理学基础上，研究参麦方对2型糖尿病(T2DM)大鼠肾脏的保护作用及其机制的研究。结合动物实验与细胞实验，探讨参麦方基于网络药理所预测出的相关靶点与通路的相互作用关系，为后续参麦方改善糖尿病肾病(DN)损伤提供理论依据。
方法：
1.网络药理学：利用中药系统药理学分析平台数据库(TCMSP)、中医百科全书平台(ETCM)收集参麦方中红参、麦冬的化学成分。通过整合药物靶标数据库(TTD)、Drugbank数据库、疾病基因与突变位点数据库(DisGeNET)筛选出DN相关的靶标建立靶点信息。运用蛋白质相互作用网络数据库(STRING)平台构建靶蛋白互作网络(PPI)，将PPI网络导入Cytoscape软件进行网络拓扑结构分析，筛选出关键靶点，利用功能注释生物信息学分析平台(DAVID)数据库对关键靶点进行基因本体论(GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析；运用Cytoscape3.2.1软件构建化合物-靶点-通路网络。
2.动物实验：大鼠适应性喂养1w后，采用随机的方法将50只大鼠均分为正常组(10只)与造模组(40只)。本实验采用高糖高脂联合STZ进行造模。正常组大鼠以普通饲料喂养；造模大鼠以高脂饲料喂养2w后，给予单次腹腔注射小剂量STZ(30mg/kg)建立糖尿病动物模型，检测大鼠尾静脉血，以随机血糖(FBG)≥16.7mmol/L判断T2DM模型造模成功，再继续高脂喂6w以维持、强化胰岛素抵抗状态，检测DM大鼠尿液中尿微量白蛋白/尿肌酐比(UACR)均达到30-300mg/g，则DN大鼠造模成功。
检测各组大鼠血糖(FBG)、24h微量白蛋白(mAlb)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)，进行记录；对DN大鼠的肾脏组织进行HE染色、Masson染色及PAS染色，观察切片；采用WestenBlot技术验证预测通路上的相关靶点。
3.细胞实验：观察参麦方对H2O2诱导HUVEC细胞氧化损伤的保护作用。15只SD大鼠随机分为3组：空白组及参麦方低(1.1g/kg)、高(5.4g/kg)剂量组，灌胃给药2次/d，连续3d，最后一次给药1h后，用10%乌拉坦麻醉，腹主动脉取血，制备含药血清。使用不同浓度的H2O2诱导HUVEC细胞0.5h，建立细胞氧化应激模型，采用CCK-8试剂检测细胞存活率，明确H2O2的最适造模浓度为800μmo1/L；利用CCK-8试剂探讨含药血清作用不同时间对HUVEC细胞存活率的影响；利用CCK-8试剂进行含药血清对HUVEC细胞及H2O2损伤的HUVEC细胞存活率的影响；利用试剂盒检测细胞培养上清液中LDH、NO、ET-1水平；采用Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡情况；利用Western Blot技术检测细胞PI3K、Akt、Bax、Bcl-2、Caspase3蛋白的表达。
结果：
1.网络药理学：利用网络合并及网络拓扑结构分析得到关键靶点15个，并对关键靶点进行基因GO功能分析及KEGG通路富集分析，预测出Akt1、VEGFA、MAPK3等为关键靶点，VEGF信号通路、TNF信号通路、PI3K/Akt信号通路为关键通路。利用网络药理学，对参麦方中活性化合物进行分析，构建活性成分-靶点-通路网络图，得到网络中关键化学成分有Ginsenoside Rh1(人参皂苷Rh1)、Ginsenoside Rh2(人参皂苷Rh2)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)、Ophiopogonanone B(麦冬二氢高异黄酮B)、Ophiopogonanone E(麦冬二氢高异黄酮E)、Ophiopogonin A(麦冬皂苷A)等，预测出的成分很有可能是参麦方治疗DN的关键活性成分。
2.体内动物实验：本次实验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠空腹FBG水平明显升高，给予低高剂量组的参麦方后，空腹FBG均有所下降；在可以反映肾功能损伤的3个指标中(mAlb、Scr、BUN)，与正常组相比，模型组均明显增加；在给予低高剂量组的参麦方治疗6w后，与模型组相比，3个指标虽未降至正常组水平，但均显著降低。这说明参麦方虽在降血糖中无太显著的作用，但是有效地减轻糖尿病对肾脏带来的损害，对肾脏起到一定的保护作用。
本次实验组织病理学结果与上述分析相同。与正常组相比，模型组大鼠肾小球血管球萎缩、肾球囊腔变大，比例失调，近端小管与远端小管的管壁薄厚不匀、管腔大小不一，肿胀，大量的炎性细胞浸润，肾脏病理结构损伤严重。给药6w后，我们发现，与模型组相比，给药组的这些病变均有所改善观察，且系膜区与基质亦没有发现明显的增生，肾小球纤维化程度也有很大程度的减轻。由此，我们可以进一步推测，参麦方可以减轻高血糖对大鼠肾脏损害的功效。
通过Western Blot结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肾组织PI3K、Akt蛋白表达水平明显下调，NF-κB蛋白表达水平明显上调。经参麦方干预后，给药组与模型组比较，能使PI3K、Akt蛋白表达水平上调，NF-κB蛋白表达水平下调，进一步推测参麦方可以改善大鼠肾脏的损伤。
3.体外细胞实验：与模型组比较，参麦方含药血清组均能提高细胞活力；给药组均能降低LDH、ET-1，提高NO；参麦方低、高剂量组均能提高PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达水平，降低Bax、Caspase3蛋白表达水平。Hochest染色显示，空白组细胞核呈弥散均匀的荧光，模型组细胞核大小不一、形状成片状或染色质聚合分裂。与H2O2组相比，经参麦方组预处理后，致密染色、收缩、核致密和染色体状态降低，凋亡明显抑制。
结论：
1.参麦方主要活性成分可调控DN发病的重要通路中的多个靶点。
2.参麦方可以上调肾组织PI3K、Akt蛋白表达、抑制NF-κB的激活，初步证实参麦方能够调控PI3K/Akt通路改善DN损伤情况，与预测的结果相吻合，通过对动物实验数据的分析，对比血糖、肾脏相关指标及肾脏组织病理切片染色，证明参麦方对DN具有一定降糖的效果，作用虽没有二甲双胍显著，但是在肾脏保护方面尤为显著。
3.参麦方含药血清对H2O2诱导损伤的血管内皮具有明显保护作用。参麦方含药血清能降低LDH、ET-1，提高NO含量；通过Westen Blot结果显示，参麦方含药血清能提高PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达水平，降低Bax、Caspase3蛋白表达水平，推测参麦方含药血清可能是通过调控PI3K/Akt通路，抑制凋亡进而改善DN损伤情况；通过Hochest33258染色，观察到参麦方含药血清能明显抑制凋亡。
基于网络药理学基础上，研究参麦方对2型糖尿病(T2DM)大鼠肾脏的保护作用及其机制的研究。结合动物实验与细胞实验，探讨参麦方基于网络药理所预测出的相关靶点与通路的相互作用关系，为后续参麦方改善糖尿病肾病(DN)损伤提供理论依据。
方法：
1.网络药理学：利用中药系统药理学分析平台数据库(TCMSP)、中医百科全书平台(ETCM)收集参麦方中红参、麦冬的化学成分。通过整合药物靶标数据库(TTD)、Drugbank数据库、疾病基因与突变位点数据库(DisGeNET)筛选出DN相关的靶标建立靶点信息。运用蛋白质相互作用网络数据库(STRING)平台构建靶蛋白互作网络(PPI)，将PPI网络导入Cytoscape软件进行网络拓扑结构分析，筛选出关键靶点，利用功能注释生物信息学分析平台(DAVID)数据库对关键靶点进行基因本体论(GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析；运用Cytoscape3.2.1软件构建化合物-靶点-通路网络。
2.动物实验：大鼠适应性喂养1w后，采用随机的方法将50只大鼠均分为正常组(10只)与造模组(40只)。本实验采用高糖高脂联合STZ进行造模。正常组大鼠以普通饲料喂养；造模大鼠以高脂饲料喂养2w后，给予单次腹腔注射小剂量STZ(30mg/kg)建立糖尿病动物模型，检测大鼠尾静脉血，以随机血糖(FBG)≥16.7mmol/L判断T2DM模型造模成功，再继续高脂喂6w以维持、强化胰岛素抵抗状态，检测DM大鼠尿液中尿微量白蛋白/尿肌酐比(UACR)均达到30-300mg/g，则DN大鼠造模成功。
检测各组大鼠血糖(FBG)、24h微量白蛋白(mAlb)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)，进行记录；对DN大鼠的肾脏组织进行HE染色、Masson染色及PAS染色，观察切片；采用WestenBlot技术验证预测通路上的相关靶点。
3.细胞实验：观察参麦方对H2O2诱导HUVEC细胞氧化损伤的保护作用。15只SD大鼠随机分为3组：空白组及参麦方低(1.1g/kg)、高(5.4g/kg)剂量组，灌胃给药2次/d，连续3d，最后一次给药1h后，用10%乌拉坦麻醉，腹主动脉取血，制备含药血清。使用不同浓度的H2O2诱导HUVEC细胞0.5h，建立细胞氧化应激模型，采用CCK-8试剂检测细胞存活率，明确H2O2的最适造模浓度为800μmo1/L；利用CCK-8试剂探讨含药血清作用不同时间对HUVEC细胞存活率的影响；利用CCK-8试剂进行含药血清对HUVEC细胞及H2O2损伤的HUVEC细胞存活率的影响；利用试剂盒检测细胞培养上清液中LDH、NO、ET-1水平；采用Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡情况；利用Western Blot技术检测细胞PI3K、Akt、Bax、Bcl-2、Caspase3蛋白的表达。
结果：
1.网络药理学：利用网络合并及网络拓扑结构分析得到关键靶点15个，并对关键靶点进行基因GO功能分析及KEGG通路富集分析，预测出Akt1、VEGFA、MAPK3等为关键靶点，VEGF信号通路、TNF信号通路、PI3K/Akt信号通路为关键通路。利用网络药理学，对参麦方中活性化合物进行分析，构建活性成分-靶点-通路网络图，得到网络中关键化学成分有Ginsenoside Rh1(人参皂苷Rh1)、Ginsenoside Rh2(人参皂苷Rh2)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)、Ophiopogonanone B(麦冬二氢高异黄酮B)、Ophiopogonanone E(麦冬二氢高异黄酮E)、Ophiopogonin A(麦冬皂苷A)等，预测出的成分很有可能是参麦方治疗DN的关键活性成分。
2.体内动物实验：本次实验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠空腹FBG水平明显升高，给予低高剂量组的参麦方后，空腹FBG均有所下降；在可以反映肾功能损伤的3个指标中(mAlb、Scr、BUN)，与正常组相比，模型组均明显增加；在给予低高剂量组的参麦方治疗6w后，与模型组相比，3个指标虽未降至正常组水平，但均显著降低。这说明参麦方虽在降血糖中无太显著的作用，但是有效地减轻糖尿病对肾脏带来的损害，对肾脏起到一定的保护作用。
本次实验组织病理学结果与上述分析相同。与正常组相比，模型组大鼠肾小球血管球萎缩、肾球囊腔变大，比例失调，近端小管与远端小管的管壁薄厚不匀、管腔大小不一，肿胀，大量的炎性细胞浸润，肾脏病理结构损伤严重。给药6w后，我们发现，与模型组相比，给药组的这些病变均有所改善观察，且系膜区与基质亦没有发现明显的增生，肾小球纤维化程度也有很大程度的减轻。由此，我们可以进一步推测，参麦方可以减轻高血糖对大鼠肾脏损害的功效。
通过Western Blot结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肾组织PI3K、Akt蛋白表达水平明显下调，NF-κB蛋白表达水平明显上调。经参麦方干预后，给药组与模型组比较，能使PI3K、Akt蛋白表达水平上调，NF-κB蛋白表达水平下调，进一步推测参麦方可以改善大鼠肾脏的损伤。
3.体外细胞实验：与模型组比较，参麦方含药血清组均能提高细胞活力；给药组均能降低LDH、ET-1，提高NO；参麦方低、高剂量组均能提高PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达水平，降低Bax、Caspase3蛋白表达水平。Hochest染色显示，空白组细胞核呈弥散均匀的荧光，模型组细胞核大小不一、形状成片状或染色质聚合分裂。与H2O2组相比，经参麦方组预处理后，致密染色、收缩、核致密和染色体状态降低，凋亡明显抑制。
结论：
1.参麦方主要活性成分可调控DN发病的重要通路中的多个靶点。
2.参麦方可以上调肾组织PI3K、Akt蛋白表达、抑制NF-κB的激活，初步证实参麦方能够调控PI3K/Akt通路改善DN损伤情况，与预测的结果相吻合，通过对动物实验数据的分析，对比血糖、肾脏相关指标及肾脏组织病理切片染色，证明参麦方对DN具有一定降糖的效果，作用虽没有二甲双胍显著，但是在肾脏保护方面尤为显著。
3.参麦方含药血清对H2O2诱导损伤的血管内皮具有明显保护作用。参麦方含药血清能降低LDH、ET-1，提高NO含量；通过Westen Blot结果显示，参麦方含药血清能提高PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达水平，降低Bax、Caspase3蛋白表达水平，推测参麦方含药血清可能是通过调控PI3K/Akt通路，抑制凋亡进而改善DN损伤情况；通过Hochest33258染色，观察到参麦方含药血清能明显抑制凋亡。