论文部分内容阅读
目的:探讨钙三醇[1α,25-dihydroxycholecalciferol,1,25(OH)2D3]对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导猪主动脉瓣膜间质细胞(PVICs)成骨分化的影响,为干预与治疗钙化性主动脉瓣膜病(calcific aortic valve disease,CAVD)提供理论支持与实验依据。方法:人Normal组(正常组)心脏瓣膜组织从主动脉夹层患者获取,人CAVD组(病变组)瓣膜组织取自行主动脉瓣膜置换术的患者,采用免疫组化和Western blot法检测Normal组和CAVD组中Runt相关转录因子2(Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的蛋白表达水平。选取8只健康家猪(雌雄不限),立即取出主动脉瓣叶,胶原酶连续消化并分离PVICs,观察细胞特性及特点,采用免疫荧光染色法进行细胞表型鉴定。利用1-5μg/ml LPS诱导细胞成骨分化,碱性磷酸酶染色(ALP染色)和茜素红S染色实验分别检验细胞成骨分化能力,实时荧光定量法(qPCR)和免疫印迹法(Western blot)法分别检测细胞成骨相关指标Runx2和OPN的表达情况,从而建立PVICs体外钙化模型;采用不同浓度(0.001-1μmol/L)钙三醇预先处理细胞2h后和4μg/ml LPS共同作用于细胞,ALP和茜素红S染色检验细胞钙化情况;qPCR和Western blot法验证细胞成骨相关指标Runx2和OPN的表达情况。4μg/ml LPS不同时限处理细胞,Western blot法检测TGF-βR、TGF-β1、p-Smad2/3表达水平;0.1μmol/L钙三醇预处理细胞2h后和4μg/ml LPS共同作用于细胞并用Western blot法检测TGF-β1及其下游经典成骨途径中Smad2/3的磷酸化水平,初步探讨其机制。结果:人瓣膜组织中Runx2、OPN、TGF-β1在CAVD组中表达明显高于Normal组(P<0.01)。成功培养原代PVICs,免疫荧光结果提示α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)染色阳性,血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)染色阴性。采用LPS刺激PVICs,与空白组相比,PVICs在2-4μg/ml LPS的诱导下ALP活性明显升高,钙盐沉积显著增强,细胞中Runx2和OPN转录及蛋白水平显著升高(P<0.05);其中4μg/ml LPS组Runx2和OPN表达水平升高较为显著(P<0.05)。同时,在4μg/ml LPS不同时限的刺激作用下,TGF-βR、TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表达水平均显著增加(P<0.05)。经钙三醇预处理后,PVICs碱性磷酸酶活性显著降低,钙盐明显沉积明显减少;与LPS组相比,钙三醇+LPS组中Runx2和OPN的转录及蛋白表达水平显著下调(P<0.01),并且TGF-β1和p-Smad2/3蛋白水平均明显降低(P<0.001)。结论:LPS可以诱导猪主动脉瓣膜间质细胞成骨分化,并且可能是通过上调TGFβ1-Smad2/3信号通路来实现的;钙三醇可能可以抑制LPS诱导的主动脉瓣膜间质细胞成骨分化,并且TGF-β1/Smads信号通路可能在其中发挥重要作用。