研究背景动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种慢性炎症性疾病,可引起心血管疾病、脑卒中和缺血性坏疽。血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化形成的初始环节,而氧化应激是引起内皮功能障碍的重要发病机制。造成AS形成的各种诱因,包括高胆固醇血症、高血糖、高血压、吸烟等的刺激会引起细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的过度蓄积,造成氧化与抗氧化防御系统失衡,引起急性氧化应激反应,造成内皮损伤,最终导致内皮功能障碍和各种氧化应激相关疾病。因此,干预氧化应激是改善AS内皮损伤的一种有效防治策略。近年来发现,细胞焦亡在氧化应激介导的血管内皮功能障碍中发挥重要作用。细胞焦亡是一种炎性细胞死亡形式,其特征是依赖于半胱天冬酶1（caspase-1）,并伴有大量促炎因子的释放。细胞发生焦亡时,细胞膜表面形成孔隙,伴随细胞肿胀、破裂、内容物释放,诱发炎症反应。经典的焦亡途径中NLRP3炎症小体的研究最为广泛,NLRP3通过ASC与pro-caspase-1结合形成炎症小体复合物,切割pro-caspase-1形成有活性的caspase-1。活化的caspase-1切割GasterminD（GSDMD）、pro-IL-1β和pro-IL-18,形成含有N-端的GSDMD、成熟的IL-1β和IL-18。N-GSDMD在细胞膜表面形成打孔通道,促进水分子内流及细胞内容物外流,诱发并扩大炎症反应,导致细胞死亡。因此,细胞焦亡是导致内皮细胞死亡的重要方式之一,揭示其机制对AS的防治有重要的临床意义。核因子κappa B（nuclear factorκappa B,NF-κB）是一系列相关的蛋白质复合体,作为异源或同源二聚体发挥转录调控的作用,广泛参与了炎症性疾病的发生。有研究发现NF-κB的p65亚基在AS的发病机制中调控了NLRP3的表达。因此,我们探究了NF-κB（p65）是否参与介导了内皮细胞焦亡的发生。NF-κB的活性控制存在复杂和高度调控的机制,其中p65亚基的乙酰化修饰对其转录活性有重要的调控作用。为了探究NF-κB（p65）介导内皮细胞焦亡发生的机制,我们发现SIRT1是一种依赖于NAD+的组蛋白去乙酰化酶,在氧化应激中是关键的调控因子。SIRT1通过多种底物的去乙酰化来调节包括基因沉默、应激抵抗、细胞凋亡、衰老和炎症等关键代谢过程。我们探究了SIRT1在内皮细胞的氧化应激反应中是否通过调控NF-κB（p65）的乙酰化水平、抑制p65入核来影响NF-κB的转录活性。这可能有助于我们更好地开展细胞焦亡在AS发病机制的研究。微小RNA（MicroRNAs,miRNAs）是非编码RNA中研究最多的,miRNA能够通过与目标m RNA结合并诱导其降解或抑制其翻译,对基因表达进行负调控。其中,miR-200a-3p广泛表达于各个组织中,研究表明miR-200a-3p对心血管系统的多种疾病具有调控作用。为了探究影响SIRT1表达的上游调控机制,探索干预SIRT1调控细胞焦亡的技术手段,生物分析学预测miR-200a-3p与SIRT1可能存在作用靶点,miR-200a-3p可能通过调控SIRT1的表达而影响细胞焦亡的发生。本研究以人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells,HAECs）为研究对象,研究NF-κB（p65）、SIRT1、miR-200a-3p在HAECs氧化应激模型中对焦亡的调控作用及其机制,为p65、SIRT1、miR-200a-3p在氧化应激反应中发挥的作用提供了新的理论依据,可能为临床防治AS提供新的策略。研究目的本研究通过建立H2O2诱导的HAECs氧化应激损伤模型,以NF-κB（p65）/NLRP3为切入点,探究SIRT1调控细胞焦亡的机制,并探索干预SIRT1调控细胞焦亡的技术手段,为抑制氧化应激诱导的血管内皮功能障碍,提供实验基础和理论依据。研究方法1.建立氧化应激诱导HAECs焦亡模型:摸索H2O2在不同浓度（0.2m M、0.4m M、0.6m M）,不同时间（2h、4h、8h）对HAECs损伤的影响,CCK-8活性检测试剂盒检测细胞的生存率,DCFH-DA探针检测HAECs不同时间点的细胞内ROS的含量,LDH活性检测和PI染色分析H2O2对HAECs的损伤程度及生存率的影响。检测H2O2在不同浓度及不同时间对细胞焦亡的影响,应用Western blot检测H2O2诱导的HAECs中焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、pro-caspase-1、Ccaspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18的表达水平。干预NLRP3炎症小体对H2O2诱导HAECs损伤的影响:运用瞬时转染构建低表达NLRP3、低表达ASC的HAECs,及应用caspase-1抑制剂VX-765预处理后,检测H2O2诱导的HAECs内焦亡相关蛋白的表达水平。2.分析NF-κB（p65）在H2O2诱导HAECs细胞焦亡中的作用:应用Western blot检测H2O2诱导HAECs后p65的表达变化。应用瞬时转染构建低表达p65细胞,使用LDH活性检测PI染色分析p65对H2O2诱导的HAECs中细胞损伤及生存率的影响。q PCR检测低表达p65后,细胞中NLRP3、IL-1β的m RNA表达水平,验证p65通过NLRP3、IL-1β调控细胞焦亡。Western blot检测p65对H2O2诱导的HAECs内焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、C-caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18的表达水平的影响。Western blot检测H2O2诱导的HAECs中细胞核、胞浆内p65的表达水平变化。3.分析SIRT1在H2O2调控NF-κB（p65）活性的机制及对细胞焦亡的影响:应用PCR及Western blot检测SIRT1在H2O2诱导的HAECs中的表达水平。瞬时转染构建过表达SIRT1的HAECs,通过检测LDH活性和PI染色,分析SIRT1对H2O2诱导的HAECs的损伤及生存率的影响,Western blot检测SIRT1对HAECs内焦亡相关蛋白表达水平的影响,H2O2诱导HAECs中ac-p65、p65的表达水平的影响,应用蛋白质免疫共沉淀验证SIRT1与p65是否存在直接相互作用。应用Western blot检测SIRT1对细胞核、胞浆内p65表达水平的影响。免疫荧光染色检测SIRT1对细胞核内及胞浆内p65的表达情况,分析p65核转位的变化。4.分析H2O2是否通过调控miR-200a-3p诱导SIRT1下调来参与细胞焦亡。1)生物分析学预测,miR-200a-3p靶向抑制SIRT1。应用PCR检测H2O2诱导HAECs后miR-200a-3p的表达变化。2)应用瞬时转染构建低表达miR-200a-3p的HAECs,通过检测LDH活性和PI染色分析miR-200a-3p对H2O2诱导HAECs损伤及生存率的影响。应用Western blot检测miR-200a-3p对HAECs焦亡相关蛋白表达水平的影响。3)构建过表达、低表达miR-200a-3p的HAECs,应用PCR及Western blot检测SIRT1的表达水平,明确miR-200a-3p对SIRT1是否存在调控作用。应用双荧光素酶报告基因实验,构建SIRT1野生型与突变型报告基因质粒与miR-200a-3p mimics或阴性对照共转染,检测荧光素酶报告基因的活性,验证miR-200a-3p与SIRT1是否存在靶向结合位点。构建共转染低表达miR-200a-3p、低表达SIRT1的HAECs,应用Western blot检测H2O2诱导的HAECs中焦亡相关蛋白表达水平的变化,验证miR-200a-3p是否通过靶向SIRT1调控细胞焦亡的发生。研究结果1.在H2O2诱导的HAECs损伤模型中,细胞内ROS水平升高,细胞培养基中LDH活性增多,细胞内焦亡相关蛋白NLRP3、pro-casepase1、C-casepase1、ASC、IL-1β、IL-18表达水平增加,提示氧化应激反应诱导细胞焦亡。通过干预NLRP3、ASC、应用caspase-1抑制剂后焦亡相关蛋白GSDMD-N、IL-1β的表达下降,提示NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡在氧化应激诱导的血管内皮损伤中发挥重要的作用。2.H2O2诱导的HAECs中ac-p65/p65的表达升高,细胞核内及胞浆内的p65表达水平均升高,且在细胞核内升高更明显,提示H2O2促进p65入核。抑制p65可抑制HAECs中NLRP3、IL-1β的表达,并抑制细胞焦亡和减轻H2O2对HAECs的损伤。3.H2O2诱导的HAECs中SIRT1的表达下降,过表达SIRT1后可以提高细胞活性及生存率,细胞焦亡相关蛋白的表达有所下降,提示SIRT1在H2O2诱导的HAECs焦亡中发挥了保护作用。蛋白质免疫共沉淀发现SIRT1与p65存在直接互相作用,SIRT1显著降低ac-p65/p65比值,抑制细胞核内p65蛋白的表达。免疫荧光染色结果表明,SIRT1抑制了p65的核转位。4.生物信息学预测miR-200a-3p可以直接靶向SIRT1。H2O2诱导下的HAECs中miR-200a-3p表达水平明显升高,miR-200a-3p降低细胞活性及生存率,促进细胞焦亡相关蛋白的表达。双荧光素酶报告基因实验证明miR-200a-3p与SIRT1存在靶向结合位点,抑制miR-200a-3p后,SIRT1的表达水平升高,证明miR-200a-3p调控SIRT1的表达。抑制SIRT1后,逆转了低表达miR-200a-3p对细胞的保护作用,提示miR-200a-3p通过靶向SIRT1调控HAECs焦亡的发生。结论1.H2O2通过诱导NF-κB（p65）来激活NLRP3炎症小体,促进HAECs焦亡,加重细胞损伤。2.SIRT1在H2O2诱导的HAECs损伤模型中表达下调,进而促进了p65的乙酰化,促进p65的核转位来诱导HAECs焦亡。3.Mi R-200a-3p在H2O2诱导的HAECs损伤模型中显著升高,可以靶向调控SIRT1;抑制miR-200a-3p可以减少HAECs的焦亡,保护细胞免受氧化应激损伤。创新点及研究意义本研究通过建立H2O2诱导的HAECs氧化应激损伤模型,以NF-κB（p65）/NLRP3为切入点,探究了SIRT1调控细胞焦亡的机制,及干预SIRT1调控细胞焦亡的技术手段,为抑制氧化应激诱导的血管内皮功能障碍,提供实验基础和理论依据。