近十几年来禽流感（Avian Influenza，AI）在世界范围内流行严重，尤其是H9N2亚型低致病性禽流感病毒流行面广，对养禽业造成严重的危害，并且多次发现其感染人引起感冒症状，属于动物源性人兽共患病病原，因此，应对该病毒的传播流行给予高度的重视。人们普遍认为AI可以经过动物间的直接接触、接触病毒污染物的间接接触和气源性等多种途径传染。然而，禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV）在养殖环境中传染情况以及通过气溶胶方式在家禽间传染的机制不详。因此本研究建立了荧光定量RT-PCR方法，对养殖环境中气载H9亚型AIV进行监测；对山东分离株的表面蛋白基因序列、病毒对家禽和哺乳动物的致病性及在哺乳动物间传染进行研究；通过反向遗传操作技术，对H9N2AIV的NA蛋白氨基酸位点进行突变，研究基因突变对毒株气源性传染的影响，探讨其气源性传染的分子机制。本研究分以下四部分内容：1气载H9亚型AIV real-time RT-PCR方法的建立及应用为了及时准确地对鸡舍环境H9亚型AIV气溶胶发生及其含量予以监测，本研究针对H9基因的保守区设计特异性的引物和探针，建立了检测禽舍环境中气载H9亚型AIV的荧光定量RT-PCR方法，对山东省部分养殖场鸡舍环境H9亚型AIV进行定量检测，并与传统的RT-PCR检测方法进行比较。结果表明，该荧光定量RT-PCR方法对H9亚型AIV具有特异性和敏感性，灵敏度达到100copies/reaction，比传统的RT-PCR方法灵敏度高；利用该方法在鸡舍环境中检测到气载H9亚型AIV的浓度为1.25~6.29×104copies/m3air。该方法的建立对于及时捕获H9亚型AIV流行信息，评估其传染危害非常必要。2H9N2AIV山东分离株HA和NA序列分析及致病性研究根据GenBank上提交的H9N2AIV的基因序列，设计特异性的引物，对山东养鸡场分离的8株H9亚型AIV的HA和NA基因序列进行测定，对氨基酸序列和系统进化进行分析；毒株接种SPF鸡和豚鼠研究其对动物的致病性及跨种传染能力；以豚鼠为实验动物，分为接种组、直接接触组和气溶胶接触组，评估分离株在哺乳动物间的传染方式：定期采集豚鼠鼻洗液，检测AIV排毒情况；收集豚鼠血液样品，检测抗体滴度；用AGI-30收集隔离器中的空气样品，测定AIV气溶胶浓度。结果表明这8株均为低致病性H9N2亚型AIV，在HA基因受体结合位点，毒株均有Leu-234(226H3number)位点，此氨基酸位点表明毒株能够与人流感样唾液酸受体相结合而感染哺乳动物；通过HA基因进化树分析分离株属于欧亚分支中的HKY28097-like分支，NA基因进化树分析除ACSDM株属于HKG997-like分支外，其他毒株属于BJ194-like分支；毒株感染SPF鸡未有致死性，而且不经过适应便能够在豚鼠肺组织内很好的复制；在哺乳动物间传染方式研究显示，H9N2AIV分离株能够通过直接接触方式在豚鼠间传染，不能通过气溶胶方式传染，但是攻毒后6~10d在隔离器环境中检测到气载的H9N2AIV；通过测定病毒气溶胶对豚鼠的半数感染量为3.58×106copies，表明H9N2AIV病毒气溶胶在实验条件下可以感染哺乳动物，其气源性传播将对人类公共卫生安全具有很大的威胁。3H9N2亚型AIV SD01株全基因序列特性分析参照Hoffmann等（2001）发表的流感病毒反向遗传各基因引物以及GenBank上的H9N2AIV的全基因序列，设计分别扩增H9N2AIV8个基因片段的特异性引物，对在家禽间能够通过气源性传染的H9N2AIV山东分离株（SD01）全基因序列进行测定及系统进化进行分析，并与2株参考株（F98株和SS94株）的氨基酸序列进行比较。结果表明HA基因与HKG997同源性最高，NA基因与HKY28097和SHF98同源性最高，PB2、PB1、NP、M、NS基因和BJ194同源性最高，PA和SHF98同源性最高；在HA裂解位点的氨基酸序列为RSSR↓GLF，毒株为低致病性禽流感；在HA基因受体结合位点，毒株有Q-234(226H3number)位点，表明能够与禽流感样唾液酸受体相结合而感染禽类；NA茎部区域出现61-63氨基酸的缺失，在红细胞吸附位点（HB位点）区域的368、402、403和432位氨基酸多出现变异，其中366-373HB区域与F98和SS94株存在差异，在神经氨酸酶头部酶活性位点区域，SD01株、F98株与SS94株在313、331和381位不同。4H9N2AIV NA蛋白氨基酸位点的突变对其传播能力的影响利用流感病毒8质粒反向遗传系统的双向转录/表达载体pHW2000和优化设计的带有BsmBI/AarI/BsaI酶切位点的引物，通过基因克隆的方法，分别构建SD01株8个基因和SS94株NA基因的PolⅠ-PolⅡ系统转录/表达质粒。通过将SD01株的7个基因与SS94株的NA基因表达质粒重组，转染MDCK和293T混合培养的细胞来拯救病毒，获得重组株R01/NASS株；利用基因定点突变技术逐个对SD01株NA基因366-373、313、381处氨基酸位点进行突变，8质粒转染细胞拯救获得不同的突变株；对拯救毒株的毒力、酶活力等生物学特性进行测定；以SPF鸡为实验动物，分为攻毒组、直接接触组和气溶胶被动感染组，在SPF鸡正负压隔离器中对各毒株在鸡群间的传染进行实验：定期收集实验鸡的口咽和泄殖腔棉拭子样品，检测棉拭子中的AIV，确定排毒情况；收集实验鸡血液样品，检测抗体滴度；用AGI-30收集隔离器中的空气样品，测定AIV气溶胶浓度。结果表明SD01株和SS94株基因重组或者SD01株NA蛋白氨基酸突变为368E、370L、313K和381D后，分别拯救的重组株R01/NASS和R01/NA381与SD01株相比，在SPF鸡胚内的复制能力减弱； R01/NASS株和R01/NA381株接种SPF鸡群后，未能检测到病毒气溶胶，气溶胶被动感染组的鸡通过棉拭子分离病毒未检测到排毒及血液样品流感抗体为阴性，表明两株病毒均失去了SD01株在家禽间能够气源性传染的能力；而SD01株NA蛋白氨基酸368和370位2个位点突变获得的重组株R01/NAHB，其神经氨酸酶活力虽有降低，但仍具有在鸡群间通过气溶胶传染的能力。因此H9N2亚型AIV的NA蛋白368、370、313和381位氨基酸对其在家禽间的气源性传染起到了重要的作用。