1.研究背景在临床上常见骨折脱位后脊髓剪切导致的急性脊髓损伤,其中颈脊髓损伤占17.75%～50%。目前脊髓损伤的动物研究多采用啮齿类动物,主要模型有切割、挫伤、压迫等。2005年Fiford首次研究了胸椎横向骨折错位对脊髓损伤的原发性损伤的影响。加拿大学者choo于2007年首次建立了脊柱骨折错位脱位脊髓损伤模型,发现C4和C5骨折错位2.5mm下的脊髓原发性损伤与挫伤导致的脊髓损伤不同。Shahrokni研究了该种模型在C5/6水平骨折错位1.50mm后大鼠颈椎固定的生物力学,但是并没有脊髓损伤的组织学和行为学的研究。我们前期研究了C4-C5骨折错位1.3,1.6和1.9mm的大鼠原发性脊髓损伤,所以本课题进一步研究其继发性损伤,包括伤后8周内的组织学改变和行为学特点。从行为学组织病理学两方面对该模型进行分级,为该模型的应用研究提供基础。2.研究目的本课题将建立不同颈椎骨折错位位移的大鼠原发性脊髓损伤模型,并在此基础上分析不同错位位移下的脊髓损伤大鼠的行为学改变和组织学特点。3.研究设计本研究共采用42只雄性SD大鼠(体重300g左右),根据C4/5错位位移分为对照组,1.65mm组和1.80mm组,分两个时间点进行研究,即原发性损伤研究(损伤后即刻处死)和继发性损伤研究(8周观察)。3.1不同错位位移下的脊髓原发性损伤研究本部分使用18只雄性SD大鼠,体重300g～335g,随机分为颈椎骨折错位1.65mm组,颈椎骨折错位1.80mm组和对照组,每组6只。磨钻去除C4/5双侧小关节。头侧椎夹置于C2(下1/2)、C3和C4两侧沟槽(关节突与横突间)中,尾侧椎夹置于C5、C6和部分C7的两侧沟槽内。头侧椎夹固定于大鼠脑立体定位仪上,尾侧椎夹连接到Instron单轴电磁伺服试验机,以200mm/s速度向背侧提升尾侧椎夹1.65mm或者1.80mm,停留0.3s,然后以2mm/s的速度回到原位。试验机记录实验组损伤过程中的力和位移。即刻灌注取材,样本大体观察和冰冻矢状位切片HE染色,计算脊髓白质出血量、灰质出血量、以及总出血量。3.2不同错位位移下的颈髓继发性损伤研究本部分使用24只雄性大鼠,体重288-330g,分对照组(n=6),1.65mm组(n=9)和1.80mm组(n=9)。进行相应骨折错位后,固定夹固定颈椎,饲养8周,进行行为学和组织学观察。3.2.1行为学研究前肢运动评分：FLS (Forelimb locomotor score)评分,在术前1天,术后第3和7天,以及术后第1至8周进行开场环境下录像,用FLS评分评价大鼠脊髓损伤后的上肢功能改变。梳理实验：在术前1天,术后1-8周,每周一次诱发大鼠自主梳理,进行录像,评价大鼠上肢运动范围。抓力试验：在术前适应一周后,术前1天测量基线值,术后第4天,以及术后第1至8周时分别测量大鼠的左、右上肢拉力,评价前肢肌力变化。3.2.2组织学研究灌注取材在术后8周,即试验终点时,过量麻醉处死大鼠,多聚甲醛心脏灌注,取C4/5为中心的长约7mm颈段脊髓,蔗糖溶液梯度脱水,干冰速冻,-80℃保存。行脊髓横断面切片,厚度20μm,间隔400μ m,取其中10套切片待用,-80℃保存。随机抽取4套,分别做HE染色观察脊髓大体形态,LFB髓鞘染色检测脊髓损伤后脱髓鞘情况,NISSL染色计数运动神经元数目,以及GFAP免疫组化染色分析胶质反应情况。4.结果4.1不同错位位移下的原发性脊髓损伤研究1.65mm组的大鼠颈椎骨折错位最大力(可视为颈椎间盘断裂时的拉力)为(16.45±3.56)N,1.80mm组为(15.57±5.73)N。1.65mm组和1.80mmm组的错位速度分别为(199.4±1.7)mm/s和(201.5±2.0)mm/s。两组最大力的差异没有显著性(P=0.756)。两组的实际位移均极为接近目标位移。1.80mm组速度与1.65mm组速度两组间差异无显著性(P=0.084)。脊髓出血量计算：1.65mm组和1.80mm组两组的白质出血量分别为(0.01±0.02)mm3和(0.09±0.05)mm3,两组的灰质出血量为(0.58±0.15)mm3和(0.88±0.21)mm3,灰质和白质出血量两组之间差异均有显著性(P自质=0.013,P灰质=0.017)。4.2不同错位位移下的颈髓继发性损伤研究行为学前肢运动功能FLS评分：1.65mm组和1.80mm组术后第1天均表现为无或仅有一个关节轻微活动,FLS评分分别为(0.8±0.4)和(0.2±0.4),组间差异无显著性(P=0.810)。术后1周时,1.65mm组的评分分别为(3.0±1.9),有两个关节(即肩关节,肘关节)的轻微运动,而1.80mm组的评分(6.5±3.0),有两个关节(肩关节,肘关节)的中度活动有或无腕关节的轻微活动。大鼠脊髓损伤后,前肢运动功能在1-2周内恢复最快,在第3周时达到一个恢复平台,评分分别为(12.2±1.5)和(10.6±1.5),而后仍有少许恢复。1.65mm组和1.80mm组在术后第8周时前肢评分分别为(14.3±0.7)和(12.1±0.9)。除第1天外的各时间点上两组评分的差异均有显著性。梳理实验：1.65mm组和1.80mmm组术后1周评分最低,评分分别为(1.4±0.7和(1.1±0.8)。在术后第8周时,评分分别为(3.4±0.5)和(3.3±0.7),大鼠前肢最大梳理范围达眼框附近。在各个时间点,两组间评分差异均无显著性。实验对照组为满分5分。前肢拉力：术前对照组、1.65mm组和1.80mmm组的拉力分别为(1.64±0.08)N、(1.59±0.11)N和(1.63±0.08)N。1.65mmm组和1.80mm组术后1周内表现爪子痉挛或者无力状态,在第1周时有轻微抓力,分别为(0.49±0.18)N和(0.83±0.13)N,两组间的差异有显著性(p<0.05)。实验对照组术后第1周的拉力为(1.44±0.20)N。1.65mm组和1.80mmm组从第1周后随时间逐渐恢复,在第8周时分别为(1.55±0.24)N和(1.39±0.16)N,均小于实验对照组(1.87±0.13)N。在各个时间点上,三组的左、右侧拉力的差异无显著性,说明脊髓损伤的对称性较好。组织学结果脊髓损伤后,逐渐形成空洞囊腔,脊髓萎缩,HE染色照片可以观察到脊髓明显萎缩变小。脊髓损伤8周时,1.65mm组脊髓损伤中心处脊髓残留面积为(3.24±0.82)mm2,1.80mm组为(2.15±0.51)mm2。1.65mm组以损伤处为中心的长度为4mm的脊髓体积为(18.07±2.31)mm3,1.80mmm组为(16.01±2.34)mm3,对照组为(25.38±1.05)mm3。三组间脊髓体积的差异均有显著性。骨折错位越大,损伤程度越重,脊髓残留体积越小。脊髓损伤第8周时,GFAP免疫组化染色后的组织切片上可见灰质和白质中均胶质细胞明显增生,特别是在空洞囊腔的边缘可见大量胶质细胞浸润,呈灶性聚集分布。白质和灰质中胶质细胞形态胞体变大,突触减少。1.80mmm组可见胶质反应明显重于1.65mmm组。对照组的胶质细胞细小,白质中神经小胶质数目少,胞体小,突触细长,未见明显的胶质活性增生及其他异常等。脊髓脱髓鞘,在Luxol fast blue染色切片上,计算以脊髓损伤中心为中点,头、尾端各2mm,4mm长的脊髓共计11片切片上的髓鞘LFB染色的总IOD值。对照组总IOD值为(2.87±0.34)x105,1.65mm组为(1.14±0.33)x105,而1.80mm组为(0.54±0.30)x105。1.65mm组和1.80mm组均与对照组的差异均有显著性(P=0.000),而1.65mm组的总IOD值大于1.80mm组(P=0.027)。结果表明：骨折错位位移越大,脊髓白质髓鞘脱失越严重。距离脊髓损伤中心尾端1.6mm处的脊髓切片为例,可见实验组在脊髓损伤区域的尾端的背侧和腹侧的髓鞘均有明显脱失。而1.80mm组不论在脊髓背侧还是腹侧的髓鞘脱失都比1.65mm组严重。尼氏染色后,在脊髓损伤中心神经元细胞的丢失最为明显,该处1.65mm组和1.80mm组的运动神经元几乎被破坏殆尽。距头尾端2mm的脊髓,1.65mm组运动神经元细胞数目少于1.80mm组运动神经元数目,差异有统计学意义(P=0.045).以距离损伤中心1.2mm为例,1.80mm组在脊髓前角上部常可见明显增生的神经胶质细胞聚集,可见明显神经元细胞固缩变形或胞体淡染,缩小呈空泡状；而1.65mm组神经元数目明显多于1.80mm组,神经元变性也较1.80mm组少。5.结论本研究成功建立了大鼠颈椎骨折错位脊髓继发性损伤模型,证实大鼠C4/5骨折错位1.65mm和1.80mm可造成不同损伤程度的脊髓损伤,继发性损伤表现为残留一定的前肢运动功能障碍,脊髓组织出现萎缩、灰质和白质破坏,形成空洞。本模型是一种临床相关的颈脊髓损伤的新模型,可用于脊髓损伤机制和治疗评价的研究。