论文部分内容阅读
目的：(1)建立一套以柱层析为主的毕赤酵母表达HBsAg的分离纯化工艺,对HBsAg进行生物学性质鉴定；(2)制备重组毕赤酵母乙型肝炎疫苗,检测重组乙型肝炎疫苗诱导小鼠抗体应答。方法：(1)毕赤酵母GS115发酵液高速离心收集菌体,加入细胞裂解液乳化高压均质机破碎,破碎液经聚乙二醇沉淀法澄清样品,上清液调整pH值,电导率和自身浓度,DEAE阴离子交换层析,收集合格样品进行苯基疏水层析,超滤浓缩脱盐,收集浓缩液,经过凝胶过滤分子筛层析收集纯化终产品；(2)Western-blot免疫印迹和还原型SDS-PAGE银染法检测HBsAg特异性,扫描电镜观察HBsAg颗粒形态,ELISA法检测HBsAg含量,高效凝胶分子筛液相方法检测HBsAg纯度；(3)AlCl3溶液缓慢恒速流加NaOH溶液制备Al(OH)3佐剂,纯化终产品稀释至一定浓度加入等体积的铝佐剂搅拌混匀,制备终浓度为20μg/ml(?)勺疫苗成品；(4)腹腔注射BALB/c小鼠重组乙型肝炎疫苗,诱导产生anti-HBs,眼内眦静脉采血,ELISA法检测BALB/c小鼠血清中anti-HBs含量,组间数据采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计学分析。结果：(1)Western-blot免疫印迹和SDS-PAGE银染见HBsAg特异性条带,电镜扫描见均一的平均直径为22nm球形颗粒,ELISA法检测HBsAg含量为440μg/ml,高效凝胶分子筛液相检测HBsAg纯度超过95.0%;(2)Al(OH)3佐剂高压灭菌后均一稳定,未出现沉淀现象,自制疫苗吸附率为99.995%,达到欧洲药典标准,(3)动物实验表明自制疫苗诱导小鼠产生的anti-HBs在第7周达到峰值163±7.384U/L,与阳性对照组有显著性差异(P<0.05)。结论：(1)成功建立了一套以柱层析为主的毕赤酵母表达的HBsAg分离纯化工艺,纯化终产品生物学性质符合欧洲药典标准；(2)自制乙型肝炎疫苗可诱导小鼠产生高浓度的anti-HBs,其研发工艺具有进一步生产开发前景。