纤维堆囊菌So0157-2木聚糖酶Xyn11B催化域的结构与性质研究

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纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)能够在以结晶纤维素滤纸为唯一碳源的无机盐培养基中生长,并伴随着有效的细胞接触性的滤纸降解。本实验室前期分离得到的一株埃博霉素产生菌S.cellulosumSo0157-2可以利用滤纸或者木聚糖作为唯一碳源进行生长,其基因组中存在多个编码不同GH家族木聚糖酶的基因。  实验室前期研究发现,S.cellulosumSo0157-2的木聚糖酶具有一些特殊的酶学性质。在对S.cellulosumSo0157-2中的一个GH11木聚糖酶Xyn11B的催化域Xyn11B-C进行酶学性质表征的过程中,我们发现Xyn11B-C除了具有一定的热稳定性外,还具有降解木聚糖只产生木二糖的特殊性质。后一性质在其他木聚糖酶中鲜有报道。  本论文首先对Xyn11B-C降解糖链的方式进行了进一步的分析。我们对Xyn11B-C作用于PNP-X2和Xyn11B-C作用于ANTS-Xn的产物分别进行了检测,结果发现Xyn11B-C水解PNP-X2产物为PNP和木二糖;水解ANTS-X4、ANTS-X5、ANTS-X6释放X2。以上实验结果表明Xyn11B-C可以从糖链的非还原端切割并释放X2。  实验室前期研究只是在氨基酸序列和酶学性质层面对Xyn11B-C以及其他纤维堆囊菌多糖降解酶进行了分析,并没有从蛋白质结构层面深入地研究纤维堆囊菌多糖降解酶降解底物的机制。为了对Xyn11B-C进行更深一步的了解,我们运用了蛋白质晶体学技术来探究Xyn11B-C的蛋白质三维结构。  在本论文中,我们构建了表达载体pGL01-Xyn11B-C,经大肠杆菌异源表达、亲和层析、切除标签、离子交换和分子筛纯化获得了符合结晶要求的Xyn11B-C的蛋白样品。经过结晶条件筛选和优化后获得了Xyn11B-C的蛋白结晶。晶体经X射线衍射和结构解析最终获得了Xyn11B-C的三维结构。Xyn11B-C共由15个β折叠链和1个α螺旋组成,具有典型的GH11木聚糖酶的右手型结构,催化位点位于“手掌”中心。我们推测了Xyn11B-C的-1、-2两个亚位点的位置。根据Xyn11B-C与其他已有的GH11木聚糖酶的氨基酸序列和结构的比对结果,我们推测Xyn11B-C的两个loopL1(第214-227位氨基酸)和L2(第316-325位氨基酸)可能是造成Xyn11B-C降解底物只产生木二糖的原因。  另外,本工作还尝试获得Xyn11B-C突变体与底物复合物的晶体,以期能了解Xyn11B-C与底物结合时的结构状态。我们纯化了Xyn11B-C(E331A/Q)两种突变了一个活性位点的蛋白,进行了共晶条件的筛选和一系列优化,目前获得了Xyn11B-C(E331Q)蛋白晶体和三维结构,并获得了Xyn11B-C(E331Q)-X3、Xyn11B-C(E331Q)-X4、Xyn11B-C(E331Q)-X5复合物的晶体。  综上所述,本论文在实验室对Xyn11B-C进行了初步酶学性质分析的基础上,进一步分析了Xyn11B-C降解木聚糖的方式,运用蛋白质晶体学技术解析Xyn11B-C和Xyn11B-C突变蛋白的结构,初步推测了Xyn11B-C蛋白结构及其与底物的结合方式,尝试从蛋白质结构层面解释Xyn11B-C具特殊的酶学性质的原因,揭示Xyn11B催化域序列特征、蛋白结构和生化性质之间的相互关系。
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