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基于适体的电化学生物传感器(电化学适体传感器),因具有响应快、灵敏度高、成本低等诸多优点而在电化学分析领域备受关注。近年来,为改善其分析性能,多种具有大比表面积和优良催化性能的纳米复合材料及各种酶放大技术被相继运用于传感器敏感界面的设计与分析测试平台的构建。凝血酶(TB)作为一种生物活性蛋白,在人体抗凝、促凝的凝血级联反应中有着重要作用,并在生物医学、临床疾病诊断中有着极大的应用价值。实现其简单、灵敏的定量检测具有十分重要的现实意义。基于此,本文利用不同的纳米复合材料并结合酶催化放大技术,构建了三种不同的TB电化学适体传感器,其电化学性能均有不同程度提高。这些测试体系对TB呈现了良好的选择性和灵敏度,并有望在临床中为某些疾病的诊断提供有效方法。1.基于核酸外切酶诱导目标物循环和酶催化放大的凝血酶电化学适体传感器该体系基于核酸外切酶催化目标物循环和酶催化放大构建了检测TB的电化学适体传感器。首先,将大量的乙醇脱氢酶(ADH)嵌入到具有3-D网状结构的3-(巯基丙基)三甲氧基硅烷溶胶(MPTS sol)中,制备了MPTS sol-ADH生物复合物,并将其通过Au-S键固定到电沉积了纳米金(AuNPs)的玻碳电极(GCE)表面,再电沉积一层AuNPs,形成AuNPs-MPTS sol-ADH纳米复合材料。然后,固载链霉亲和素(SA),通过其与生物素之间的特异性结合,进一步修饰用电活性物质亚甲基蓝(MB)标记的双链DNA (MB-dsDNA)。最后引入TB和核酸外切酶(RecJf)的混合物。通过TB与TB适体(TBA)间的特异性结合,形成TB-TBA复合物,dsDNA发生解离,RecJf外切酶将TBA剪断后释放目标物TB参与后续多次循环,并在ADH与AuNPs的催化作用下,实现电化学信号的放大,进而提高传感器的灵敏度。该传感器的检测范围为0.5 pmol·L-1～100 nmol·L-1,检测限为0.17pmol·L-1。2.基于卟啉铁/G-四链体为信号标签及纳米金-乙醇脱氢酶-石墨烯纳米复合材料为纳米载体的凝血酶电化学适体传感器该体系以卟啉铁/G-四链体为信号标签,并以纳米金-乙醇脱氢酶-石墨烯(AuNPs-ADH-GSs)纳米复合物为纳米载体,构建了一个仿三酶逐级催化放大的TB电化学适体传感器。首先,采用大比表面积的GSs作为固载平台以实现大量ADH的固载。通过ADH与AuNPs间Au-N键,将AuNPs固载于纳米复合材料ADH-GSs表面,形成AuNPs-ADH-GSs生物纳米复合材料。然后,将卟啉铁嵌入氨基标记的TB适体(TBA)中形成卟啉铁/G-四链体,并将其固载于AuNPs-ADH-GSs表面。最后,用牛血清白蛋白(BSA)封闭AuNPs表面剩余的活性位点,得到卟啉铁/(G-四链体标记的AuNPs-ADH-GSs生物纳米复合物(第二适体TBA Ⅱ复合物)。通过“夹心型”反应,TBA Ⅱ复合物被捕获到电极表面,并产生相应的电化学信号。最后,通过ADH、卟啉铁/(G-四链体作为辣根过氧化酶(HRP)模拟酶和NADH氧化酶的三重催化,实现了电化学信号的放大和传感器灵敏度的提高,其检测限为0.3 pmol·L-1。3.基于酶和多孔金@钯核壳纳米结构协同催化放大的凝血酶电化学适体传感器该体系基于葡萄糖氧化酶(GOx)、多孔金@钯(Au@Pd)核壳纳米结构和卟啉铁/G-四链体的协同催化,构建了信号放大型TB电化学适体传感器。多孔Au@Pd核壳纳米结构不仅具有优越的过氧化物酶性能,还具有大比表面积,这使其能固载大量的氨基标记的TB适体(NH2-TBA)和电活性物质甲苯胺蓝(Tb)。另外,将卟啉铁嵌入到NH2-TBA中形成具有过氧化物模拟酶特性的卟啉铁/(G-四链体。接着,用GOx封闭多孔Au@Pd核壳纳米结构表面剩余的活性位点,即形成TB第二适体复合物(卟啉铁/G-四链体-Au@ Pd-Tb-GQx生物共轭探针)。通过修饰在电极表面的NH2-TB、目标物和第二适体复合物的“夹心型”反应,进而得到相应的电化学响应信号。利用GOx、Au@Pd核壳纳米结构和卟啉铁/G-四链体的协同催化,使电化学信号得到放大,灵敏度得到提高,其检测限为 0.037 pmol·L-1。