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第一部分不同浓度的蔗糖溶液玻璃化冷冻经上游法处理后的人类精子 目的: 探讨使用非渗透性冷冻保护剂—蔗糖溶液,玻璃化冻存大体积(0.5ml)人类精子的可行性,旨在为临床提供更适宜的精子冻融方法。 方法: 收集正常精液标本58份,每份精液经上游法处理,收集上游精子悬液,分成6份,1份作为对照组(未处理),其余5份分别用常规慢速冷冻法、0.15M、0.20M、0.25M、0.30M蔗糖溶液冷冻精子,复苏后比较6组间精子活动率、前向运动精子百分率、精子质膜完整性、精子DNA完整性及顶体完整性。 结果: ①精子活动率、前向运动百分率结果:经冷冻复苏后,所有冷冻组精子活动率、前向运动百分率与冷冻前上游组精子活动率(95.7±2.0)％和前向运动精子百分率(92.2±3.8)%比较均下降,差异显著(P<0.05),其中0.20M蔗糖冷冻组、0.25M蔗糖冷冻组和常规慢速冷冻组的精子活动率分别为(58.5±6.3%)、(53.7±10.3)%和(54.2±5.3)%,3者间差异无显著性(P>0.05),均明显高于0.15M蔗糖冷冻组(46.8±7.2)%及0.30M蔗糖冷冻组(49.7±11.2)%(P<0.05)。前向运动百分率结果显示:0.20M蔗糖冷冻组的精子前向运动率(47.5±6.8%)显著高于常规慢速冷冻组(36.4±8.7%)、0.15M蔗糖冷冻组(35.4±7.4%)、0.25M蔗糖冷冻组(34.8±9.9)%及0.30M蔗糖冷冻组(24.3±9.3)%,差异显著(P<0.05),其中0.15M蔗糖冷冻组、0.25M蔗糖冷冻组与常规慢速冷冻组比较差异无显著性(P>0.05);0.30M蔗糖冷冻组显著低于常规慢速冷冻组(P<0.05)。 ②精子膜完整率结果:所有冷冻组精子膜完整率较冷冻前上游组(99.0±0.9)%均显著下降(P<0.05)。在冷冻组中0.20M蔗糖冷冻组的精子膜完整率(73.2±6.9)%显著高于其它冷冻组(P<0.05)。常规慢速冷冻组,0.25M蔗糖冷冻组和0.30M蔗糖冷冻组分别为(63.9±6.3)%、(67.0±11.2)%和(62.9±12.4)%,3者间无统计学差异(P>0.05),0.15M蔗糖冷冻组(59.7±8.8)%显著低于其它冷冻组(P<0.05)。 ③精子DNA完整率结果:经冷冻复苏后,常规慢速冷冻组、0.15M、0.20M、0.25M和0.30M蔗糖冷冻组精子DNA完整率分别为(87.2±4.7)%、(88.5±2.9)%、(90.1±2.8)%、(88.1±3.9)%和(88.6±3.1)%,组间无统计学差异(P>0.05);但均显著低于冷冻前上游组(93.0±3.3)%(P<0.05)。 ④精子顶体完整率:经冷冻复苏后,所有冷冻组精子顶体完整率较冷冻前上游组(94.1±2.8%)均显著下降(P<0.05)。0.15M、0.20M、0.25M和0.30M蔗糖冷冻组精子DNA完整率分别为(48.4±8.6)%、(53.7±10.0)%、(53.8±8.4)%、(53.4±12.5)%,组间无统计学差异(P>0.05);均显著高于常规慢速冷冻组(35.9±9.7)%(P<0.05)。 结论: 终浓度为0.20M的蔗糖溶液玻璃化冷冻人类精子解冻后可以获得更高前向运动精子百分率,精子膜完整率和精子顶体完整率;相较常规慢速冷冻法,终浓度0.20M的蔗糖溶液玻璃化冷冻法更能够有效避免精子在冻融过程中的损伤,并且玻璃化冷冻方法简便、快速、经济、安全有效。 第二部分0.20M蔗糖溶液玻璃化冷冻附睾精子的研究 目的: 探讨使用终浓度为0.20M蔗糖溶液玻璃化冷冻附睾精子(PESA)的可行性及应用性。 方法: 实验前首先对蔗糖组精子进行受精能力验证。收集IVF和ICSI周期中未成熟的卵母细胞(MI),进行未成熟卵培养。卵母细胞经培养成熟后,使用0.20M蔗糖组冷冻复苏后的上游精子行ICSI操作,并统计受精率,卵裂率及优质胚胎率。验证可行性后,再通过比较终浓度为0.20M蔗糖溶液玻璃化法(蔗糖组)和常规慢速冷冻法(常规组)的精子复苏率、ICSI操作后其卵母细胞受精率、卵裂率及优质胚胎率及临床妊娠率,评价两种冷冻方法的冷冻效能。 结果: 经培养成熟23枚卵母细胞后,使用0.20M蔗糖组冷冻复苏后的上游精子行ICSI操作,受精率,卵裂率及优质胚胎率分别为73.9%、88.2%和20.0%。18例患者附睾精子标本经两种方法冷冻后,蔗糖组和常规组中各有1例样本未见活动精子(蔗糖组和常规组冷冻失败的样本并不为同1例样本),余均有活动精子。蔗糖组与常规组的复苏率均低,分别为(22.0±12.7)%和(23.7±8.5)%,两者差异无显著性(P>0.05)。78枚成熟的卵母细胞使用蔗糖组的精子行ICSI操作,其卵母细胞受精率、卵裂率、优质胚胎率及临床妊娠率分别为88.5%,100%,68.1%和50%;95枚成熟的卵母细胞使用常规组的精子行ICSI操作,其卵母细胞受精率、卵裂率、优质胚胎率及临床妊娠率分别为85.3%,98.8%,63.8%和33.3%,结果无统计学差异(P>0.05)。由于样本较少,临床妊娠率未做统计学检验。 结论: 终浓度为0.20M蔗糖溶液玻璃化法可作为冷冻附睾精子的一种方法,操作过程简便、快速。经玻璃化和常规慢速法冷冻复苏后的精子行ICSI操作的结果比较,其卵母细胞的受精率及胚胎的发育潜能并无明显异常,提示使用蔗糖溶液玻璃化冷冻附睾微量精子能够应用于临床。