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虫生病原真菌(EPF)对于自然地调节昆虫、壁虱和螨虫的数量,发挥着重要的作用。到目前为止,已发现了超过750种昆虫病原真菌。其中,绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一种最要的、研究最充分的虫生病原菌之一。其广泛的分布于世界各地的土壤之中,对大部分的昆虫都具有生防能力。因为其有效的致病性,无毒害和无污染等优点,使其成功的商品化应用于多个国家的生物防治领域。已有研究表明,胞外磷酸酶在绿僵菌侵染并致死害虫寄主过程中发挥了重要作用,因此加强对绿僵菌胞外磷酸酶的研究,将有助于为绿僵菌的侵染和致病机理的研究提供参考。一、不同磷源对金龟子绿僵菌CQMa102生物量及生成胞外磷酸酶的影响。本文利用摇瓶培养方法探究了无机磷(KH2PO4)、简单有机磷(植酸钠、磷酸苯二钠)和蛋白有机磷(酪蛋白)为单独磷源条件下,绿僵菌生物量、产胞外酸性磷酸酶以及酪氨酸蛋白磷酸酶、丝/苏氨酸蛋白磷酸酶活性的影响。实验结果显示：(1)酪蛋白作为磷源的培养基,绿僵菌生物量高达4.94g/L；胞外蛋白的分泌量最大(395.0mmg/L),较其它磷源高出2-7倍；酸性磷酸酶的活性也是最高的(1208.5U/μg),是其它磷源诱导下的2-10倍；但是酸性磷酸酶的比活和蛋白磷酸酶的活性却显著低于KH2PO4和磷酸苯二钠为磷源下的酶活。(2) KH2PO4做磷源的培养基,绿僵菌的生物量(3.24g/L)与磷酸苯二钠为磷源下的生物量(3.32g/L)没有显著的差异；其蛋白分泌量和酸性磷酸酶活性都显著高于磷酸苯二钠下的值；但是酸性磷酸酶的比活和蛋白磷酸酶活性均低于磷酸苯二钠诱导下的酶活。(3)植酸钠为磷源的培养基中,绿僵菌生物量(0.59g/L)、酸性磷酸酶的活性和比活、以及酪氨酸蛋白磷酸酶的活性均是最低的；但是其蛋白的分泌量显著高于磷酸苯二钠中的量,并且丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酶活显著高于酪蛋白为磷源中的活性。(4)在磷酸苯二钠为磷源的培养基中,由于胞外蛋白的分泌量最低(53.95mg/L),所以导致酸性磷酸酶的比活最高(5.99U/μg);同时其蛋白磷酸酶的活性和比活也是最高的。这表明,酪蛋白作为磷源,最有利于绿僵菌菌丝的生长、胞外蛋白和酸性磷酸酶的分泌；其次为加入KH2PO4和磷酸苯二钠的培养基；加入植酸钠的培养基不利于绿僵菌的生长代谢。然而,加入磷酸苯二钠的培养基,最有利于酪氨酸蛋白磷酸酶、丝／苏氨酸蛋白磷酸酶的分离纯化。二、绿僵菌胞外磷酸酶的毕赤酵母表达及其酶特性分析。李振轮等已经从绿僵菌胞外蛋白中纯化出了一个新的酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPase),并且成功克隆出了该PTPase基因全长序列,利用文库筛选获得了该基因的DNA序列(GenBank No. DQ302474),并且已经证明了该PTPase在体外能特异的使蝗虫Toll受体和Trans-Go1gip230蛋白脱磷酸化。辛静通过RT-PCR方法,已经成功的对绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶进行基因克隆,并且构建了PTPase基因的毕赤酵母表达载体。本实验通过使用不同遗传霉素筛选方法对重组的毕赤酵母进行遗传霉素的抗性筛选,然后进行PCR检测,对正确克隆的菌株进行甲醇诱导培养,筛选出高效表达的菌株。将筛选出的高效表达菌株进行甲醇诱导培养,从粗酶液中通过超滤离心和Ni柱亲和层析方法,分离纯化出目的蛋白。对目的蛋白进行SDS-PAGE, IEF-PAGE以及Western blot,并进行酶学特性分析。实验结果显示：(1)目的蛋白酪氨酸蛋白磷酸酶的分子量为85kDa,等电点为6.15；最适pH为6.5,最适温度为70℃。(2)抑制剂和金属离子对PTPase酶活的影响：Ca2+(50mM)和Ba2+(1mM)几乎不影响目的蛋白PTPase活性。抑制剂Dithiothreitol, β-mercaptoethanol, N-ethylmaleimide均表现出抑制作用；EDTA(20mM时,减少32.04%),阴离子.F(1mM时,减少34.44%)和金属离子Ag+(1mM时,减少37.21%),Cu2+(5mM时,减少45.63%),Fe2+(10mM时,减少24.89%),Zn2+(1mM时,减少30.52%)均显著抑制了PTPase活性；而Sodium molybdate(10mM时,增加54.92%),Sodium tungstate(20mM时,增加58.75%),EDTA(10mM时,增加48.08%),Ca2+(20mM时,增加68.62%),Fe2+(1mM时,增加37.87%),Mg2+(20mM时,增加65.16%),Mn2+(20mM时,增加90.94%),Ba2+(20mM时,增加45.02%)以及Co2+(10mM时,增加110.41%)却显著的促进了PTPase活性。(3)酶底物特异性分析结果显示：在最适温度(70℃)和最适pH(6.5)下,O-phospho-L-tyrosine和pNPP做底物,酪氨酸蛋白磷酸酶表现出了同样高的活性；当底物为O-phospho-L-serine和O-phospho-L-threonine时,目的蛋白同样表现出了活性,但是活性远远小于前两种底物。