背景与目的Zn²⁺是人体必需的微量元素之一，在维持人体的正常生理功能中，发挥重要作用。Zn²⁺对维持300多种酶的生理功能是必需的，如碱性磷酸酶、乙醇脱氢酶、DNA聚合酶、铜锌超氧化物歧化酶等。此外，Zn²⁺参与细胞信号转导、抗氧化系统的组成和免疫调节。人体缺乏Zn²⁺会出现一系列的临床症状。与此同时，许多研究发现Zn²⁺是大气污染颗粒物（particulate matter，PM）中水溶性过渡金属的主要成分，在PM引起的呼吸系统疾患特别是炎性疾病如慢性支气管炎、支气管哮喘中发挥重要作用。在作业现场，吸入氧化锌烟，可引起金属烟尘热综合征。体内外实验发现，Zn²⁺可以诱导呼吸系统细胞产生肿瘤坏死因子（tumor necrosisfactor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-6和IL-8等前炎性细胞因子。因此在Zn²⁺引起的呼吸系统损害作用过程中，前炎性细胞因子可能发挥关键作用。呼吸道肺泡上皮细胞层是呼吸系统抵御外界各种有害因素的第一道防线。外源性有害因素，如病原菌、大气污染颗粒物、变态反应原等通过与呼吸道上皮细胞层相互作用，损害正常的细胞功能，干扰呼吸系统的稳态，从而对人体造成损害作用。许多研究发现呼吸道肺泡上皮细胞层不仅是一层防御屏障，而且具有合成和分泌多种细胞因子的潜能，如TNF-a、IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）和转化生长因子（transforming growth factor,TGF）等。这些细胞因子可能在各种刺激因素的致病作用过程中发挥作用。本实验通过体外培养转化的人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞，使其接触不同浓度的Zn²⁺和ZnO颗粒，从mRNA和蛋白质水平上分析受试物能否诱导A549细胞表达TNF-α、IL-6和IL-8前炎性细胞因子。初步研究Zn²⁺在含zn²⁺PM引起的呼吸系统损害过程中的作用。材料与方法1材料转化的人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549细胞系，Zn²⁺和ZnO颗粒。2方法2.1实验分组空白对照组：用F-12培养基培养A549细胞3h、24h。ZnO颗粒作用组：用分别含50μM、100μM、250μM和500μM ZnO颗粒的FBS-free F-12培养基培养A549细胞3h、24h。Zn²⁺作用组：用分别含50μM、100μM和250μM Zn²⁺的FBS-free F-12培养基培养A549细胞3h、24h。2.2检测方法和指标运用MTT比色法检测Zn²⁺和ZnO颗粒对A549细胞活性的影响；以β-actin基因为内参照，运用半定量RT-PCR技术检测各个浓度的Zn²⁺和ZnO颗粒对A549细胞IL-6，IL-8和TNF-αmRNA表达的影响；采用放射免疫试剂盒测定Zn²⁺和ZnO颗粒对A549细胞IL-6、IL-8和TNF-a蛋白质表达的影响。2.3统计学分析运用SAS8.2统计软件包对数据进行分析，单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）比较ZnO和Zn²⁺对A549细胞活性的影响和IL-6、IL-8和TNF-α表达水平的影响；当ANOVA比较有差异时，最小显著差法（least significant difference,LSD）用于各组之间的两两比较；检验水准为α=0.05。结果与分析1．用含50μM、100μM、250μM、和500μM ZnO颗粒的FBS-free F-12培养基培养A549细胞24h；含50μM、100μM和250μM Zn²⁺的FBS-free F-12培养基培养A549细胞24h，MTT比色法检测Zn对细胞活性的影响。和对照组相比，差异没有统计学意义（P＞0.05），表明该实验所采用的ZnO和Zn²⁺浓度对A549细胞活性未产生明显影响。2．RT-PCR结果显示：用含50μM、100μM、250μM和500μM ZnO颗粒的FBS-free F-12培养基培养A549细胞3h时；含50μM、100μM和250μM Zn²⁺的FBS-free F-12培养基培养A549细胞3h时，和对照组相比，IL-6、IL-8和TNF-αmRNA表达增高（P＜0.05），且Zn浓度越高，mRNA表达水平越高，呈明显剂量效应关系。相同浓度的ZnO颗粒和Zn²⁺诱导的mRNA表达水平相比，差异没有统计学意义（P＞0.05）。24h时，A549细胞中IL-6和IL-8 mRNA表达水平下降，和对照组相比，差异没有统计学意义（P＞0.05），TNF-αmRNA表达水平继续维持在较高水平，和对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明Zn可以通过某些途径，引起肺泡上皮细胞前炎性细胞因子mRNA的表达水平升高；对不同前炎症细胞因子的影响所表现出来的时间上的差异，说明Zn可能通过不同的途径影响不同促炎症细胞因子mRNA的表达量和／或稳定性。3．RIA结果显示：用含50μM、100μM、250μM和500μM ZnO颗粒的FBS-free F-12培养基培养A549细胞3h时；含50μM、100μM和250μM Zn²⁺的FBS-free F-12培养基培养A549细胞3h时，A549细胞IL-6、IL-8和TNF-α蛋白表达水平升高，和对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），Zn浓度越高，前炎症细胞因子表达水平越高，呈现明显的剂量效应关系；24h时，IL-6、IL-8和TNF-α前炎症细胞因子表达水平进一步升高，和3h时同浓度的Zn相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。相同浓度的Zn²⁺可以诱导A549细胞表达更高水平前炎性细胞因子蛋白，两者相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示，Zn²⁺诱导A549细胞表达前炎症细胞因子能力比ZnO强，可能是由于Zn²⁺水溶性大，能和细胞膜充分接触从而进入细胞内，诱导细胞表达更高水平促炎症细胞因子。结论本研究通过体外实验证实，Zn²⁺和ZnO颗粒可以诱导人Ⅱ型肺泡上皮A549细胞表达IL-6、IL-8和TNF-α前炎性细胞因子；提示在含Zn大气颗粒物质引起的呼吸系统疾患和吸入高浓度的ZnO烟引起的金属烟尘热综合征中，人Ⅱ型肺泡上皮细胞是前炎症细胞因子的重要来源。