第一部分：microRNA在左向右分流性肺动脉高压大鼠肺组织中的表达肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH)是指静息状态下用右心导管(RHC)测得的平均肺动脉压(mPAP)至少高于25mmHg的一种复杂病理生理综合征。肺动脉高压既可以是原发性的,也可以是继发于其它一些疾病。肺动脉高压包括肺内或与肺相关血管的收缩紧缩,这使得心脏很难向肺供血。长久以往,受影响的血管就会形成纤维化,进而继续升高肺内的血管压力和影响血流量。此外,心脏增加的工作负荷会使得右心室肥厚,以至于心脏无法将血泵入肺内,最终引起右心力衰竭。血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和基质细胞等细胞都参与到了PAH的发展过程。左向右分流性肺动脉高压是一种最常见的肺动脉高压。左向右的分流会引起肺血管流量和压力的持续增高,导致内皮细胞和平滑肌细胞异常增生,使得肺血管重构,最终形成肺动脉高压。microRNA (miRNA)是一类仅由18-25个核苷酸构成的单链小分子RNA,广泛存在于真核生物中。其通过对特定靶基因mRNA的翻译过程起抑制或直接降解mRNA发挥作用。目前已知miRNA几乎参与了各种病理生理过程,并发挥重要作用。但是它在肺动脉高压发生发展过程中的作用却鲜有报道。本课题以左向右分流性肺动脉高压大鼠模型为主要研究对象,初步研究miRNAs与肺动脉高压发生发展的相关性,并预测与肺动脉高压相关的靶基因位点,为深入探讨应用miRNAs靶向治疗肺动脉高压提供理论依据。方法1.左向右分流性肺动脉高压大鼠模型的建立(1)运用颈动静脉分流术建立左向右分流性肺动脉高压大鼠模型。(2)在相应时相点检测分流组和对照组大鼠的平均肺动脉压(mPAP)和右心室肥厚指数(RVHI)。(3)取大鼠肺组织,行HE染色观察肺小动脉形态变化。2.应用芯片检测技术,分析肺动脉高压形成后miRNAs表达谱的变化(1)应用微阵列芯片技术,检测差异性表达的miRNAs。(2)应用RT-PCR技术验证明显差异性表达的miRNAs。3.应用靶基因预测软件预测差异性表达的miRNAs所调控的与肺动脉高压相关的靶基因。结果1.成功构建大鼠左向右分流性肺动脉高压大鼠模型,且与对照组相比,分流组大鼠的肺动脉收缩压(PASP)和右心室肥厚指数(RVHI)增高。HE染色显示分流组肺小动脉血管壁增厚,管腔狭窄。2.芯片结果显示,在肺动脉高压大鼠中有89种miRNA上调,20种miRNA下调。上调的miRNA包括miR-130b、miR-98和miR-193等等。下调的miRNA包括miR-127、miR-379和miR-541等等。对其中差异性最明显的miR-130、miR-127和miR-98,用RT-PCR技术进行了验证。3.运用靶基因预测软件,得到miR-98和miR-130b的预测下游靶基因包括Yod1, Edn1, PPARG, HSP40, Esml。结论：1.运用套管法连接大鼠颈总动脉和颈外静脉,可形成持续的低流量体肺分流,诱导肺血管重构,进而形成左向右分流性肺动脉高压。2.在肺动脉高压大鼠模型中存在明显差异性表达的miRNAs,并且可以通过RT-PCR技术进行验证。miRNA在肺动脉高压的形成过程中可能起重要作用,而预测出的靶基因包括Yod1, Edn1, PPARG, HSP40, Esm1。第二部分：高原患儿Bnip3与自噬水平对心肌缺血再灌注损伤的影响研究高原先天性心脏病的发病率大概为1.37%,是平原人群的2到3倍。2005年中国人口普查发现,藏族人群总数为5,416,021,大部分生活在海拔3000米以上。因此有很多患有先天性心脏病的藏族人需要接受心脏手术。由于医疗卫生水平的改善和更便捷的交通,青藏高原越来越多的先天性心脏病患者得到了去平原心脏中心接受心脏手术的机会。然而,关于高原病人心脏手术期间心肌缺血再灌注损伤的报道却很少。青藏高原居民的平均动脉氧分压大概为57mmHg。目前已肯定慢性缺氧能够提高Bnip3的表达,而Bnip3能够通过抑制雷帕霉素靶蛋白来提高自噬水平。自噬是细胞内的一种自体降解过程,也就是细胞内的衰老的蛋白质和细胞器被降解和回收的过程。平时自噬保持基线水平,但在应激条件下,例如养分耗竭或者缺氧,会进一步被诱导升高。高水平自噬可以使得青藏高原居民适应高海拔环境并耐受缺氧。体外和体内试验研究表明自噬在心肌缺血再灌注损伤中起重要作用,提高自噬能力可以保护心肌免受缺血再灌注损伤。特别是自噬的基础水平对维持细胞稳态和保护细胞对抗功能紊乱的细胞器具有重要作用。然而,关于人类的这方面临床报道甚少。基于以上情况,我们推测西藏的先天性心脏病患者比平原患者能够更好的抵抗心脏手术中的心肌缺血再灌注损伤,这是由于长期的慢性缺氧导致他们具有更高的基础自噬水平。为了验证这一假设,我们研究了接受心脏手术的高原患儿和平原患儿基础自噬水平以及其上游与缺氧相关的蛋白Bnip3的变化,以探讨自噬水平对心肌缺血再灌注损伤的影响。方法：1.高原组和平原组患者的入选标准(入选标准包括患者年龄,性别,民族,疾病类型等)2.高原组和平原组的心肌缺血再灌注损伤程度的比较(1)检测比较两组心肌肌钙蛋白的变化。(2)检测比较两组脑钠肽的变化。(3)应用HE染色技术,检测两组心肌病变情况。(4)应用TUNEL染色技术,检测两组心肌病变情况。(5)应用透射电镜技术,检测两组心肌病变情况。3.利用Western Blot来评价自噬相关蛋白LC3Ⅱ, Beclin1和LAMP2以及它们的上游蛋白Bnip3。(1)利用Western Blot来评价自噬相关蛋白LC3Ⅱ, Beclinl和LAMP2水平的变化。(2)利用Western Blot来评价上游蛋白Bnip3水平的变化。结果：1.12名长期居住在青藏高原的藏族患者(海拔>3000m)与12名长期居住在平原的患者(海拔<500m)成功入选本研究。2.高原组术后6小时的心肌肌钙蛋白浓度,脑钠肽增长速度以及术后凋亡比明显低于平原组。平原组心房组织的心肌病理改变比高原组严重。3.无论是术前还是术后的LC3Ⅱ, LAMP2以及上游的Bnip3水平,高原组都明显高于平原组(P<0.05)。而缺血再灌注后Beclin1的水平在高原组和平原组无明显差异性(P>0.05)。结论：高原先天性心脏病患者在体外循环心脏手术期间比平原患者更耐受缺血再灌注损伤,这可能与高原患儿长期缺氧导致Bnip3和基础自噬水平增高有关。