背景和目的恶性胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性脑肿瘤,约占所有脑肿瘤的50%以上,星形细胞瘤是最常见的脑胶质瘤。根据他们的侵袭性,世界卫生组织(WHO)将它们划分为(1)I级:毛细胞型星形细胞瘤(PA),好发于儿童;(2)II级:低度恶性星形细胞瘤(LGA),占所有神经胶质瘤的25%,好发年龄为30-40岁;(3)III级:间变型星形细胞瘤(AA),易转化为Ⅳ级;(4)IV级:多形性胶质母细胞瘤(GBM),好发年龄为45~60岁。恶性星形细胞瘤(MA)主要包括AA及GBM,其中GBM占50%~80%。其中I级和II级的低度恶性神经胶质瘤(LGG)和III级和IV级或高度恶性神经胶质瘤(HGG)。在过去的十年中,尽管在脑胶质瘤治疗方面,包括手术切除、放化疗及肿瘤免疫治疗等综合治疗取得了巨大的进展,但高度恶性胶质瘤患者中位生存期仅12-15个月,主要是由于对恶性胶质瘤形成的潜在分子机制缺乏了解。脑恶性胶质瘤具有侵袭性极高、预后极差的生物学特点,从而导致其易复发,死亡率高,为了有效解决这一临床难题,非常有必要深入研究恶性胶质瘤发生及侵袭的分子机制,识别参与胶质瘤形成与发展的新基因,从而有针对性的研究预防和治疗恶性胶质瘤,才能有效的寻找新的治疗策略,改善患者的预后。肌细胞增强因子2家族(myocyte enhancer factor 2,MEF2)是一类发挥多种生理功能的细胞内转录因子,该家族包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D四个成员。它们在骨骼肌、心肌、神经组织和免疫系统的发育过程和正常生理功能的维持中发挥重要功能。如同其他重要的发育相关因子一样,MEF2D也参与了癌症的发生过程。MEF2D促使正常细胞发生恶性转化的现象在白血病中被首先报道。部分急性淋巴细胞白血病的患者的1号染色体与19号染色体发生易位,造成了MEF2D部分编码区与DAZAP1发生融合,产生了MEF2D/DAZAP1与DAZAP1/MEF2D两种融合蛋白。通过体外细胞实验,研究者发现过表达MEF2D不仅赋予正常细胞在低血清条件下的增殖能力,加快其分裂速度,而且对细胞凋亡的产生也有抑制作用,能够增强转化细胞的存活。后来有研究发现,MEF2D参与了肝癌的发生。研究证实,MEF2D在肝癌中异常高表达,这种高表达与肝癌的预后不良相关。而且MEF2D通过调控细胞周期g2/m,在肝癌的致瘤性方面扮演着重要角色。在肝癌细胞中下调mef2d表达,将导致细胞生长抑制。有研究证实mef2d的替代多聚腺苷酸化亚型在正常和gbm脑组织差异表达。而且,mef2家族蛋白还参与了神经胶质瘤相关因子2的调控。此外,mef2d能够激活bcl-w的转录表达,这使得mef2d可以在肿瘤细胞的抗凋亡中发挥作用。然而,对于mef2d在恶性神经胶质瘤的表达谱和功能知之甚少。我们前期的研究发现mef2d在恶性胶质瘤组织及恶性胶质瘤细胞系(u87mg、u251mg)中异常高表达,不断有证据表明mef2d表达可能是恶性胶质瘤发生和进展中的关键因子。在这项研究中,我们试图研究恶性胶质瘤中mef2d的功能和表达,通过研究mef2d表达水平与恶性胶质瘤细胞致瘤性的相关性,进一步阐明mef2d在恶性胶质瘤发生中的生物学功能,提供新的用于恶性胶质瘤临床预后参考的蛋白分子,为今后针对恶性胶质瘤发生、发展制定新的治疗策略提供新靶点。方法:1.细胞系和细胞培养人恶性胶质瘤细胞系,u87mg(从含有gfap阳性细胞恶性脑瘤衍生)和u251mg(从一个恶性胶质瘤患者分类为iv级来源的),hela细胞(hela细胞用作mef2d阳性对照)均购自美国典型培养物保藏中心。初级星形胶质细胞培养物根据前人方法所述取得。生长环境:细胞培养液dmem,10%胎牛血清,置于含有5%二氧化碳、37摄氏度的培养箱中,根据细胞在镜下观察的生长情况,判定细胞传代时间,通常每1-2天将生长旺盛的u87mg、u251mg、hela、星形胶质细胞传代。2.原代培养/伦理声明本研究所采用的人脑恶性胶质瘤标本(肿瘤组织及癌旁正常组织)从成都军区总医院神经外科手术切除获得,由成都军区总医院的伦理审查委员会审查批准,并取得病人或亲属的书面知情同意。恶性胶质瘤组织切成小块。机械操纵后获得单细胞悬浮液。对于原发性星形胶质细胞培养,样品按照前人方法(具体见实验部分)的程序,由成都军区总医院的伦理审查委员会批准,取得孕妇的书面知情同意,从流产胎儿获得。方法简要地说,在除去脑膜后,从前囟脑组织切成片,用胰蛋白酶消化。将消化的细胞通过一个钢网过滤并在补充有15%fbs中dmem中培养,免疫荧光法检测gfap的表达。3.免疫组化免疫组织染色是关于使用链霉菌抗生物素-过氧化物酶连接法,对手术获取的恶性胶质瘤标本,进行福尔马林固定、石蜡包埋和组织切片。用mef2d和ki67抗体分别检测mef2d和ki67的表达。苏木素用于对细胞核染色。根据tunel细胞凋亡检测试剂盒的实验方法进行凋亡实验。4.实时荧光定量pcr(qrt-pcr)根据rna提取试剂盒的操作指南对恶性胶质瘤细胞系(u87mg、u251mg)提取总rna。实时荧光定量pcr按照前人实验描述的方法进行。简要地说,第一链cdna合成和扩增根据primescripttmrt试剂盒的操作进行;实时荧光定量pcr根据sybr预混料前的taq与rotor-gene的6000qrt-pcr系统的操作说明进行。以下为引物序列:mef2d(正向)5’-agggaaataaccaaaaaactaccaaa-3’;mef2d(反向)5’-gctacatgaacacaaaaacagagacc-3’;gapdh(正向)5’-gcgagatcgcactcatcatct-3’;gapdh(反向)5’-tcagtggtggacctgacc-3’。gapdh的mrna水平被用于归一化。在基因表达水平上的变化倍数使用2△△ct法计算。5.病毒载体慢病毒载体由王博士(病理科,哈佛大学医学院)提供,其中包括lv-gfp(过表达绿色荧光蛋白对照组),lv-mef2d(过表达mef2d),lv-shmef2d-1、lv-shmef2d-2(不同程度下调mef2d表达)和lv-ctrl(阴性对照组)。6.westernblot分析根据标准实验方法进行蛋白质样品和免疫印记。简言之,将细胞用裂解缓冲液在12,000rpm离心15min后,用bca蛋白测定试剂盒对组织或细胞蛋白质的浓度进行测定。然后通过sds-page在凝胶上分离总蛋白。7.增殖试验被不同慢病毒感染后的细胞以1000个每孔的浓度种植于96孔板中。mts溶液(3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2h-etrazolium,innersalt,四氮唑蓝盐化合物)根据promega推荐的方法来检测细胞增殖率。8.克隆形成实验u87mg细胞用文中所示的慢病毒载体感染后,按照每个培养皿2000个细胞浓度接种在3.5cm的培养皿中。u251mg细胞和星形胶质细胞用文中所示的慢病毒载体感染后,每孔100个细胞的浓度接种于24孔板中。将细胞放置在37℃,在5%co2细胞培养箱中培养10天。随后将细胞用福尔马林固定,用结晶紫染色。我们定义50个细胞作为一个克隆。9.细胞周期检测通过流式细胞仪pi染色后如前人中描述的细胞周期流程操作。简而言之,将细胞铺于6孔板中,每孔2×105个细胞的浓度并用慢病毒处理。处理后48小时,收集细胞于240μlpbs和560μl的100%乙醇中,并在-20℃下固定过夜。细胞沉淀通过离心收集,并再悬浮于含有20mmedta和1mg/mlrna酶的500μlpbs中,然后在37℃下孵育1小时。pi溶液(50微克/毫升)的混合物用于样品染色。然后将样品进行流式细胞仪分析,并在536nm的激发波长和617nm的发射波长进行检测。10.流式细胞仪检测细胞凋亡将需检测的细胞铺于6孔板中,每孔2×105个细胞的浓度,并用慢病毒处理。慢病毒处理后48小时,收集细胞,胰蛋白酶处理,并用完全培养基洗涤一次。细胞(5×105)重新悬浮500μl1×bindingbuffer缓冲液中,并用异硫氰酸荧光素(fitc)标记的膜联蛋白v染色。染色后立即进行流式细胞仪检测分析。11.动物实验研究六周龄的雄性balb/c裸小鼠用于本研究,购自成都达硕实验动物有限公司。在小鼠(n=12)颅内注射感染了10moi的lv-shmef2d-1或lv-ctrl5×106u87mg细胞。40天内每天记录他们的死亡情况。所有动物实验均经成都军区总医院动物研究伦理审查委员会审查通过。肿瘤的体积通过公式计算“v=(长度×宽度2)/2”。12.统计分析每组实验至少重复三次,实验所得数据,采用spss20.0软件进行统计分析。mef2d表达和存活之间的相关性由秩数检验评估。mef2d表达与其他变量之间的关系,我们使用了两种独立样本t检验。实时荧光定量pcr、细胞的生长速度和克隆形成的结果均通过双侧独立样本t检验。比较多样本量差异的显著性使用单向评估anova或双向anova方差分析,所有数值以平均值±标准差表示。p<0.05(*)和p<0.01(**)分别表示“差异显著”和“差异非常显著”。结果:1.mef2d表达水平升高预示恶性胶质瘤患者预后不良。为了研究mef2d的在患有恶性胶质瘤患者预后中的作用,我们使用qrt-pcr法进行检测恶性胶质瘤患者中mef2d的mrna水平。在iii级和iv级组织学分类的恶性胶质瘤标本中,分为一个mef2d高组和mef2d低组(我们通过相对定量rq平均值定义mef2d高/低)。与mef2d低组中相比,在mef2d高组中的患者预后较差(p=0.031)。此外,这些患者的样本mef2dmrna水平与世界卫生组织分级(2007年)正相关(p=0.048)。idh1/2突变也与mef2dmrna水平正相关(p=0.029)。但是,mef2dmrna水平和组织学分类之间没有显著的关联(p=0.064)。为了确认mef2d在肿瘤细胞中的定位,我们对恶性神经胶质瘤样本进行免疫组织化学检测。免疫组织化学染色表明,mef2d蛋白主要定位于癌细胞的细胞核中。因此,通过westernblot和免疫组化评估,mef2d蛋白的表达水平在恶性胶质瘤肿瘤组织与邻近正常组织相比表达更高。mef2dmrna表达水平在这些样品中也通过qrt-pcr进行测定,mef2d在肿瘤组织中mrna的表达水平比相邻的正常组织表达显著更高(p=0.03,0.02和0.02)。此外,与mef2d的蛋白水平低的星形胶质细胞相比,u87mg,u251mg和hela癌细胞(hela细胞用作mef2d阳性细胞系),mef2d在癌细胞系中的表达水平比星形胶质细胞更高(p<0.04)。这些结果表明,恶性神经胶质瘤细胞系具有异常高表达的mef2d。2.mef2d下调抑制恶性神经胶质瘤细胞系的增殖。因为恶性神经胶质瘤细胞系的mef2d表达水平高,我们用携带特异性靶向的mef2dmrna的短发夹rna的慢病毒载体(lv-shmef2d-1,lv-shmef2d-2)或对照组(lv-ctrl)感染的u87mg和u251mg细胞。感染后72小时,我们通过免疫印迹和qrt-pcr检测,研究u87mg和u251mg细胞的mef2d蛋白和mrna的水平。在u87mg和u251mg恶性神经胶质瘤细胞系中,lv-shmef2d-1和lv-shmef2d-2导致了大约65-95%mef2d蛋白表达下降。qrt-pcr数据还显示,在恶性神经胶质瘤细胞系中,shrna也下调了mef2d的mrna水平。mef2d下调被认为减少了u87mg细胞的增殖。在感染lv-shmef2d-1或lv-shmef2d-2的u251mg细胞中也有同样的情况,但对照组lv-ctrl细胞没有这种效果(p=0.02和0.01)。此外,u87mg细胞感染lv-shmef2d-1或lv-shmef2d-2后的细胞克隆数受此影响,随mef2d的水平下降而减少(p=0.01和0.01)。在u251mg细胞中也得到了类似的结果(p=0.01和0.02)。因此,mef2d的下调可以减少u87mg和u251mg细胞中的克隆数,这表明mef2d在恶性神经胶质瘤细胞系的增殖中至关重要。3.mef2d影响恶性神经胶质瘤细胞系的细胞周期和凋亡。为了研究mef2d促进恶性神经胶质瘤细胞系的增殖机制,使用流式细胞术分析细胞周期进程。u87mg和u251mg恶性胶质瘤细胞感染了lv-shmef2d-1,lv-shmef2d-2,或是lv-ctrl。这与此前肝癌中的报道结果相一致,在u87mg和u251mg细胞沉默mef2d表达导致细胞周期的s期和g2/m期的阻滞。mef2d可以调节在肝癌中靶基因如cdkn1a,gadd45a,和gadd45b的转录。为了证实在恶性胶质瘤中,mef2d是否调节这些基因,我们研究了mef2d的靶基因mrna水平。我们的数据证实,在u87mg细胞中沉默mef2d表达导致cdkn1a,gadd45a和gadd45b的表达增加。我们还研究mfe2d的下调是否导致恶性神经胶质瘤细胞的凋亡。使用流式细胞术分析检测lv-shmef2d-1或lv-shmef2d-2处理后的肿瘤细胞凋亡水平。凋亡细胞的百分比通过fitc-膜联蛋白v/pi染色来确定。我们的数据表明,不同mef2d水平细胞凋亡率显著不同。在lv-shmef2d-1和lv-shmef2d-2感染组凋亡率分别为39.4%和38.2%。与此相反,lv-ctrl感染组有较低的凋亡率(6.1%)。这些结果表明,mef2d通过诱导细胞周期s期和g2/m期的延迟,影响肿瘤细胞凋亡、抑制恶性胶质瘤细胞的增殖。另外,剪切的parp水平表明,细胞凋亡途径被诱导。因此,在mef2d沉默的细胞系中,剪切的parp蛋白的水平升高。综上所述,我们的结果强化了先前的发现,即mef2d促进癌细胞的增殖,参与细胞周期进展,并且在抑制细胞凋亡中起重要作用。4.mef2d的过表达促进星形胶质细胞的增殖和细胞周期进程。我们接下来研究mef2d过表达是否促进了正常脑的星形胶质细胞的增殖和细胞周期进程。感染过表达lv-mef2d的星形胶质细胞的mef2d水平升高,western印迹分析证实感染lv-mef2d之后的mef2d蛋白水平显著增加。qrt-pcr数据表明,lv-mef2d感染的星形胶质细胞的mfe2d的mrna水平高于对照细胞(p=0.01)。通过mts测定感染lv-mef2d或lv-gfp的星形胶质细胞的增殖率。我们发现,mef2d过表达增加星形胶质细胞的增殖(p=0.03)。此外,与对照病毒相比(lv-gfp),过表达mef2d升高星形胶质细胞的菌落数(p=0.04)。此外,我们对慢病毒过表达mef2d的星形胶质细胞的细胞周期进程进行了评估的。在星形胶质细胞的过度表达mef2d增加g0/g1期的细胞的百分比,同时降低细胞百分比中的g2/m和s期。总的来说,mef2d促进星形胶质细胞的增殖,并加速在星形胶质细胞g2/m期的过渡。5.mef2d的下调削弱了恶性胶质瘤细胞的致瘤性。为了研究mef2d是否促进恶性胶质瘤的致瘤性,在已建立的小鼠恶性胶质瘤模型基础上进行mef2d下调影响的检测。与对照组相比,mef2d低表达的恶性胶质瘤异种移植组具有更高的存活率。值得注意的是,颅内注射的u87mg细胞40天后,mef2d缺陷组有50%的存活率,而对照组均没有存活。lv-shmef2d-1感染组(5.6±5.3立方毫米)比Lv-CTRL感染组中肿瘤的平均大小显著较小(15.2±8.7立方毫米)(P=0.04)。Western免疫印迹、q RT-PCR和免疫组化染色检测均显示MEF2D在LV-CTRL感染组肿瘤中存在广泛表达,而在LV-sh MEF2D-1感染组的肿瘤中,MEF2D的表达明显降低。为了确认移植了shMEF2D的恶性神经胶质瘤细胞的小鼠的存活率增加是否是由于细胞增殖抑制或细胞毒作用影响,我们通过Ki67染色和TUNEL测定法,分别分析移植瘤肿瘤细胞的增殖和凋亡。结果表明,相比于Lv-CTRL感染组,Lv-shMEF2D-1感染组具有更弱的Ki67染色和更强的TUNEL染色。对MEF2D表达情况、Ki67和TUNEL阳性细胞进行计数。结果表明在Lv-CTRL-和Lv-shMEF2D-1治疗组,MEF2D阳性率分别为82.5%,3.9%。Lv-CTRL-和Lv--shMEF2D-1治疗组的Ki67在细胞中表达百分比分别为64.2%和28.6%。TUNEL染色表明他们的凋亡率分别为8.6%和57.8%。这些结果表明体内的MEF2D缺陷降低了恶性胶质瘤的致瘤性。结论:1.在恶性胶质瘤患者标本中,异常高表达MEF2D,从而导致恶性胶质瘤的预后较差。2.通过下调MEF2D介导了细胞周期S期和G2/M期的阻滞并促进细胞凋亡,进而抑制恶性神经胶质瘤细胞系的增殖。3.MEF2D在星形胶质细胞的过度表达通过调节细胞周期进程加速细胞增殖。4.裸鼠恶性胶质瘤模型显示,MEF2D缺乏可以阻止恶性神经胶质瘤在体内形成。5.最后我们的结论是MEF2D可以充当恶性神经胶质瘤的潜在致癌基因,因此可作为一个恶性胶质瘤治疗的候选目标。