纤维素是一种最大天然的可循环能源,人类对其的应用已有很久的时间。合理地开发与利用纤维素资源能够有效地应对能源危机、粮食短缺、环境污染等危机。现今使用微生物及其分泌的纤维素酶来分解纤维素是一种高效并且结果显著的方式。作为一种饲料添加剂,纤维素酶具有能够显著提高饲料的消化和利用率、改善饲料品质、促进动物生产等功能,在畜牧业中有着广阔的应用前景,但由于它的酶活性低、成本高等原因,使它的不能被很好的被使用。目前,利用体外定向进化技术改造纤维素酶基因及构建高产纤维素酶的基因工程菌,已经获得研究人员的关注。本试验从能够有效产纤维素酶的菌康氏木霉(T.koningii)及黑曲霉(Aspergillus niger)的DNA文库中通过PCR获得外切葡聚糖酶CBHⅠ基因,并对其进行DNA改组,构建重组表达质粒pMG36e-CBHⅠ,并利用高压电击手段转入到植物乳酸杆菌中,实现CBHⅠ基因在植物乳酸杆菌中的表达。主要内容以下:(1)使用RT-PCR技术成功克隆得到康氏木霉黑曲霉CBHⅠ基因,两种纤维素酶基因与NCBI公布的纤维素基因同源性均大于99%。(2)对克隆得到的两种纤维素酶基因进行DNA改组,将改组纤维素酶基因与pMD19-T质粒连接并转入大肠杆菌中,得到两株纤维素酶基因改组I号(g1)和改组II号(g2)。g1在172位点碱基由G变为A,氨基酸由精氨酸变为色氨酸;在636位点碱基由A变为G,氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸;g2在172位点碱基由G变为A,氨基酸由精氨酸变为色氨;在554位点碱基由G变为A,氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸;在1114位点碱基由T变为C,氨基酸未发生变化,均为谷氨酰胺。将改组的纤维素酶基因与表达载体pMG36e连接,构建可在乳酸杆菌中表达的重组质粒载体。(3)将重组质粒载体通过电击转化转入植物乳酸杆菌中,并通过红霉素抗性筛选及质粒PCR选出重组菌,并对其分泌的纤维素酶活进行测定。结果显示,在低糖MRS培养基中,g1的滤纸酶活最高可达4.83 U/L,g2的滤纸酶活最高可达4.19 U/L;两者的最适反应温度均为50℃,g1的最适pH为5.0,g2的最适pH为5.5。