论文部分内容阅读
通过比对分析已发表的昆虫氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)氨基酸序列并结合美国白蛾(Hyphantria cunea)ITRAQ结果设计编码APN的apn基因特异引物,通过RACE-PCR技术获得美国白蛾中肠氨肽酶N全长序列,NCBI BLAST分析显示其属于美国白蛾氨肽酶N3,命名为hcapn3,Gen Bank登录号为KJ013598。序列分析表明Hc APN3具有典型的氨肽酶结构特征,具有谷氨酸锌化氨肽酶(Gluzincin)结构域和羧基端(ERAP1_C)结构域。在昆虫细胞中表达108k Da的Hc APN3蛋白。在原核表达系统表达了58k Da的Gluzincin结构域和49k Da ERAP1_C的结构域蛋白。并以ERAP1_C的结构域蛋白为抗原制备了Hc APN3特异性抗体。利用Western blot对Hc APN3在美国白蛾虫体各组织中的分布进行免疫定位,结果显示Hc APN3主要存在于美国白蛾中肠后部,而在中肠前部只有少量分布,其他组织中则没有分布。分别提取了Cry1Ac及Cry9Ea6蛋白,利用胰蛋白酶(trypsin)对其进行消化,获得有活性的毒素片段,结果显示Cry1Ac与trypsin质量比为40:1,Cry9Ea6与trypsin质量比为20:1时,消化效果最好。差速离心法提取美国白蛾中肠BBMV蛋白,利用免疫定位发现Hc APN3存在于BBMV上。有活性的Cry1Ac和Cry9Ea6毒素蛋白分别与BBMV、Hc APN3蛋白及两个结构域进行Ligand blot结合分析,结果显示Cry9Ea6毒素与BBMV,Hc APN3蛋白及两个结构域蛋白均能发生结合,并且与Gluzincin结构域结合的信号强度明显高于ERAP1_C结构域。利用两个结构域蛋白分别对Cry9Ea6毒素进行增效分析,结果显示Gluzincin结构域对Cry9Ea6毒素有明显的增效作用,而ERAP1_C结构域则没有增效作用。体内与体外实验结果表明Cry9Ea6可以与Hc APN3特异结合。对于Cry1Ac的配体印迹分析发现Gluzincin结构域可与Cry1Ac特异性结合,但ERAP1_C结构域未能与Cry1Ac结合。本研究首次分离了美国白蛾氨肽酶基因,并初步探索了其与Bt毒素的结合情况,为下一步功能研究提供基础。