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缺血性心脏病及继发的心功能衰竭仍是全球发病率和死亡率最高的疾病之一。对于这类疾病传统的治疗方法例如血管成形术,支架及溶栓药物治疗虽可减轻导致缺血的原因但不能对缺血后的心肌损伤进行再修复。目前尚没有治疗药物或手术方式能使具有收缩功能的心肌组织替换缺血后的心脏疤痕。最近出现的细胞治疗技术利用最新鉴定出的祖细胞群,介导血管及心肌的再生,为缺血性心脏病的治疗带来了新的前景。但是早期大规模临床调查研究发现,不论是直接注射祖细胞到缺血部位还是用药物动员骨髓祖细胞到循环中的细胞治疗方法,临床治疗功效不显著。研究发现只有少数被移植的或被动员(到循环中)的祖细胞能驻留在缺血部位,缺血部位的祖细胞驻留不足是细胞治疗功效不高的主要障碍。而且,目前的细胞动员药物并非特异性动员祖细胞,部分炎症细胞也同时被动员到缺血组织,使缺血损伤部位的微环境恶化,从而破坏祖细胞的再生能力。因此,加强移植的祖细胞在缺血部位的招募和停留以及选择性动员内源性骨髓祖细胞方法的研究对于加强祖细胞再生能力从而提高细胞治疗的功效具有重要意义。CXC趋化因子受体-4(CXCR4)是G蛋白偶联的受体超家族成员之一。CXCR4参与了发育过程中的心脏和血管器官发生,造血细胞的生成,及免疫应答等生物活动。最近研究表明CXCR4与其配体基质细胞趋化因子(SDF-1)的相互作用对于调节缺血介导的骨髓祖细胞的招募以及在骨髓微环境中维持骨髓祖细胞的稳定起重要作用。本课题研究了CXCR4信号通路在维持和动员骨髓祖细胞中的分子机制(第一部分)及CXCR4表达增多对于心肌来源的祖细胞在缺血的心脏的招募和驻留的调节(第二部分)。结果表明,以CXCR4信号通路为靶点的细胞治疗能加强祖细胞介导的心血管修复。目的:在骨髓微环境中,基质细胞趋化因子(SDF-1)及其受体CXC趋化因子受体-4(CXCR4)的相互作用对于调节骨髓祖细胞(bone marrow progenitor cell)的动员起重要作用。缺血损伤能破坏SDF-1和CXCR4之间的相互作用,释放骨髓祖细胞到外周循环,把循环中的祖细胞招募到缺血组织从而促进血管再生。药物性CXCR4阻断剂AMD3100也能显著动员骨髓祖细胞到外周血。但是SDF-1/CXCR4信号通路的其他传导途径目前还不清楚。c-kit是一个细胞膜上的酪氨酸激酶,干细胞因子(SCF)的受体,研究发现c-kit对骨髓祖细胞的动员和对缺血组织中的修复中也起着重要作用。因此本实验研究SDF-1/CXCR4信号通路与c-kit激酶活性之间的功能关系。方法与结果:干细胞克隆形成分析试验发现AMD3100既不能动员c-kit基因敲除小鼠的骨髓祖细胞也不能动员骨髓移植后表达突变的持续性激活c-kit小鼠的骨髓祖细胞。而且,小鼠体内皮下注射AMD3100,Western-blotting结果表明骨髓中c-kit激酶的磷酸化活性降低,细胞流式分析表明CXCR4减少。在细胞黏附实验中,把从小鼠中分离得到的骨髓祖细胞放在用血管黏附分子(VCAM-1)处理过的细胞培养皿中培养,实验发现SDF-1和SCF增加c-kit激酶的磷酸化活性,AMD3100抑制SDF-1介导的c-kit激酶活性,但不能抑制SCF介导的c-kit激酶活性。还发现SDF-1介导的c-kit激酶活性同时还需要激活Src非受体型酪氨酸激酶:用选择性Src激酶抑制剂能阻断c-kit激酶的磷酸化活性以及c-kit与Src激酶之间的相互作用。结论:上述结果表明SDF-1/CXCR4在骨髓微环境中通过Src调节c-kit激酶活性,对骨髓祖细胞动员起调节作用。目的:心肌缺血导致内源性心肌祖细胞池迅速耗竭,通过注射外源性祖细胞的细胞治疗方法因为外源性心肌祖细胞不能有效地被招募到缺血部位而受到限制。最近的报道表明基质细胞趋化因子(SDF-1)及其受体CXC趋化因子受体-4(CXCR4)在招募缺血介导的骨髓来源的循环干细胞中起关键调节作用,但是CXCR4在心肌祖细胞中的表达却很低。因此,本实验研究缺氧对心肌祖细胞CXCR4表达的影响,经缺氧预处理后的心肌祖细胞经静脉注射后招募到缺血组织的效率及在小鼠心肌缺血模型中对心功能的保护作用。方法和结果:研究发现缺氧预处理增加CXCR4在心肌来源的祖细胞(CLK:Cardiosphere-derived, Lin-/c-kit+ progenitor cell)中RNA及蛋白水平的表达;体外细胞迁移实验表明缺氧后显著地增加CLK细胞在体外的迁移,同时给予CXCR4小分子干扰RNA后能显著阻断此效应;在小鼠心肌缺血动物模型中,静脉注射缺氧预处理与非缺氧预处理的CLK细胞发现,缺氧预处理后的CLK细胞能更多的被招募到缺血组织,术后四星期心肌梗死面积显著减少,心功能显著提高。而且,给予CXCR4特异性抑制剂能明显阻断上述缺氧预处理后产生的效应。体外细胞缺氧预处理发现,CXCR4的增高依赖于缺氧诱导因子α(HIF-1α),给予HIF-1α小分子干扰RNA能阻断CXCR4 RNA及蛋白表达的增加。蛋白芯片分析缺氧预处理后的细胞培养上清液发现,SDF-1分泌显著增多,同时还有超过300种细胞因子分泌,提示缺氧预处理后存在潜在的旁分泌保护作用。结论:SDF-1/CXCR4信号通路介导了缺血预处理后产生的保护效应。表明SDF-1/CXCR4信号轴可以作为加强以心肌祖细胞为基础的再生性治疗的一个新的治疗靶点。