脉冲电场对细胞、组织的生物学效应越来越受到重视。低强度电脉冲导致细胞膜穿孔，以此为依据的电化学疗法和电基因转染技术为肿瘤治疗带来希望；高强度电脉冲作用于细胞内结构，引起线粒体结构和功能的变化，细胞发生凋亡，这为恶性肿瘤残余病灶的治疗带来希望。本实验组既往发现：能量可控电脉冲产生的高强度电场，导致细胞凋亡，肿瘤组织生长受限、侵袭能力抑制，荷瘤动物的生存期延长。线粒体为能量供应场地，也是凋亡发生的重要结构，凋亡信号刺激线粒体膜通透性增加，线粒体膜孔道(PTP)开放，释放如细胞色素C、凋亡诱导因子(AIF)等凋亡蛋白，凋亡相关信号通道的激活，导致凋亡的发生。本实验以卵巢癌移植瘤为实验对象，通过三部分的研究，分析出电脉冲诱导卵巢癌线粒体变化的最佳剂量学水平，并对线粒体中相关凋亡蛋白及其凋亡信号通道上相关因子变化的检测，分析线粒体结构和功能的变化，证实高强度电脉冲诱导卵巢癌凋亡的线粒体机制。 第一部分能量可控电脉冲影响卵巢癌线粒体膜的剂量学研究 目的：通过检测线粒体膜PTP孔道的改变，分析对线粒体膜影响最大的脉冲参数组合，研究电脉冲对线粒体的作用的剂量学基础，求证此参数组合电场对细胞凋亡的影响，为脉冲引起的线粒体凋亡的研究奠定剂量学依据。 材料与方法：以卵巢癌裸鼠皮下移植瘤为实验对象，采用L9(34)正交表设计脉冲电场四因素三水平，脉冲电场作用于各实验组卵巢癌移植瘤，共聚焦显微镜检测罗丹明123(Rh123)的染色程度分析电脉冲对线粒体膜PTP的变化，运用最佳参数组合的脉冲电场作用于卵巢癌组织，RT-PCR测定Bcl-2 mRNA的变化。 结果：在电脉冲参数中，电压、频率、脉宽显著影响线粒体膜PTP的开放，作用时间的长短对其无明显影响(P＞0.05)；当电压为1000V、脉宽为250ns、频率为1000Hz时，细胞内Rh123荧光强度最强，脉冲电场对线粒体膜PTP影响最显著。在此电场参数作用下，卵巢癌移植瘤Bcl-2 mRNA表达明显下降。 结论：不同参数组合的电脉冲对线粒体膜有不同强度的作用。高电压、高频率可使线粒体膜PTP最大程度开放。然而并非脉宽越低，对线粒体膜PTP的影响越大；当脉宽达到一定范围内，出现对线粒体膜最大程度的效应。利用分析出的最大参数组合脉冲作用于卵巢癌，可降低凋亡相关基因Bcl-2 mRNA的表达，提示电脉冲可诱导线粒体凋亡的发生，为脉冲的机制研究奠定基础。 第二部分高强度电脉冲促卵巢癌线粒体凋亡的实验研究 目的：证实高电压、高频率电脉冲可导致细胞的凋亡与影响细胞内结构如线粒体是否有必然的联系，研究高强度电脉冲是否影响了线粒体凋亡的途径。 材料与方法：人卵巢癌囊腺癌(SKOV3)接种于裸鼠皮下建立肿瘤模型，数字随机法分为实验组1-4和对照组，采用第一部分所得结果的高强度电脉冲作用于卵巢癌移植瘤。即刻行光电镜观察，与对照组对比分析细胞膜、细胞器及其内容物、细胞核的改变。于脉冲作用后0h、6h、12h、24h取材，罗丹明123(Rh123)标记卵巢癌组织内线粒体膜，激光共聚焦测定线粒体PTP的变化；免疫组化和免疫荧光法检测细胞色素C(Cyt C)和凋亡诱导因子(AIF)的动态变化。 结果：高强度电脉冲处理后，细胞形态保持完整，线粒体数量增加，细胞核膜破裂、异染色质增多，凋亡小体增加。线粒体外膜通透性增加，PTP开放；高强度电脉冲作用后0h，AIF表达显著增加，随时间其强度有所降低，当脉冲作用后12-24小时，细胞内表达持续存在，其荧光强度值为别为86.15±2.05％、70.45±1.92％、62.35±2.56％、50.67±1.87％，较对照组显著升高；脉冲作用后0h，Cyt C表达高达89.05±2.35％；6h-12h后，表达的水平稍微降低，其荧光强度值为76.48±1.93％及57.62±2.08％，24h小时后表达细胞减少，其值为41.72±2.30％，仍高于对照组。 结论：高强度电脉冲作用后，卵巢癌细胞内线粒体的数量和功能发生改变，线粒体相关的凋亡蛋白释放入细胞质，诱导凋亡。线粒体凋亡途径被激活，并能在脉冲处理后6-12小时持续发挥作用，提示高强度电脉冲对凋亡信号途径的调控作用，通过对线粒体凋亡功能的影响抑制卵巢癌的生长与增殖，为高强度电脉冲治疗肿瘤残留提供了可能。 第三部分高强度电脉冲对线粒体凋亡的信号传导的影响 目的：通过对调控线粒体凋亡信号通路上相关分子的检测，分析高强度电脉冲诱导卵巢癌凋亡的可能线粒体途径，明确高强度电脉冲产生的凋亡效应与线粒体改变的相关性。 材料与方法：人卵巢癌囊腺癌(SKOV3)接种于裸鼠皮下建立肿瘤模型，随机分为实验组1-4和对照组，高强度电脉冲参数为第一部分实验所得，作用于实验组卵巢癌移植瘤。于脉冲处理后0h、6h、12h、24h取出标本。免疫荧光法检测电压依赖阴离子通道(VDAC)的变化，Fluo-3/AM探针标记后激光共聚焦定位细胞内外Ca2+分布，荧光分光光度计测量Ca2+含量变化，RT-PCR测定bcl-2、bax的mRNA水平。与对照组比较其统计学差异。 结果：高强度电脉冲作用0h后，实验组卵巢癌细胞VDAC表达显著下降至17.99±1.15，与对照组46.14±1.55比较，差异显著；Ca2+向线粒体聚积，其含量明显增加，达16.50±1.08，与对照组6.40±1.51比较，有显著性差异。VDAC表达呈下降趋势，于脉冲作用后6h、12h、24h，荧光强度分别为5.85±1.19、6.10±1.31、3.80±0.53.Ca2+含量在脉冲作用后6h，亦呈下降趋势，12h后，其含量低于对照组，24h后Ca2+在线粒体内聚积趋于消失。bcl-2在高强度电脉冲作用后mRNA显著下调，其相对灰度值为0.15，而对照组mRNA的灰度值维持于0.48，脉冲处理后bax表达增加，其灰度相对值为0.69，而维持于脉冲处理后24h内，同对照组比较，有显著性差异。 结论：高强度电陡脉冲作为一种强的外昴刺激信号，作用于线粒体外膜VDAC，使线粒体通透性下降，信号进入细胞质，第二信号Ca2+的分布和含量发生改变，细胞内钙超载，同时bcl-2的表达下降，bax表达增加，Bcl-2家族凋亡基因的表达波动，增强了凋亡信号在细胞传导和发生效应，导致卵巢癌组织凋亡的发生，证实高强度电脉冲调控线粒体凋亡的发生。