论文部分内容阅读
目的：采用重组报道基因的方法建立一套可筛选环境雌激素和检测青春期前儿童体内雌激素水平的雌激素受体介导的转录激活测评系统。
方法：本实验分为两个部分：第一部分：利用基因工程技术构建雌激素受体表达载体pSG5-ER以及含雌激素受体反应元件的荧光素酶报道载体pGL3-ERE-LUC及pGL3-overERE-LUC。1.采用PCR方法扩增pCR3.1上的ERcDNA编码序列，将扩增片段插入pGEM-Teasy载体中，进行PCR产物的克隆；筛选出阳性重组体，用EcorⅠ酶切后，将目的片断插入pSG5，建成质粒pSG5-ER。EcorⅠ单酶切鉴定，并用ApaⅠ酶和SacⅠ酶双酶切鉴定，得到的片断大小均符合预期的长度。
2.设计ERE和overERE两种雌激素受体反应元件的寡核苷酸序列，化学合成反向互补的单链，将其退火后与用KpnⅠ和MLUI酶切的pGL3-promoter连接，建成质粒pGL3-ERE-LUC及pGL3-overERE-LUC。用SalⅠ酶切质粒鉴定，得到的片断大小符合预期长度。
第二部分：雌激素及类雌激素测评系统建立的探索1.质粒pGL3-ERE-LUC、pGL3-overERE-LUC和pGL3-promoter分别瞬时单转染入MCF-7细胞，观察不同浓度的雌激素受体配体对该环境雌激素测评系统的影响。
2.质粒pGL3-ERE-LUC或pGL3-overERE-LUC和pSG5-ER瞬时共转染入MCF-7细胞，观察不同浓度的雌激素受体配体对该环境雌激素测评系统的影响。
结果：1.依据基因工程的原理成功的构建了雌激素受体真核表达质粒载体pSG5-ER和两种含雌激素受体反应元件的荧光素酶重组报道基因载体pGL3-ERE-LUC和口pGL3-overERE-LUC。
2.以MCF-7细胞系为环境雌激素测评系统的工具细胞，单转染pGL3-ERE-LUC或pGL3-overERE-LUC，不能出现雌激素受体配体的剂量反应曲线。
3.以MCF-7细胞系为环境雌激素测评系统的工具细胞，将pGL3-ERE-LUC或pGL3-overERE-LUC分别与人类雌激素受体表达载体pSG5-ER共转染，出现雌激素受体配体的剂量反应曲线。提示当MCF-7细胞共转染了重组报道基因载体和雌激素受体表达载体后，可以建立起较敏感的环境雌激素测评系统。