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随着人民生活水平的提高及生活习惯的改变,冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary heart disease,CHD)的发病率逐年升高,现已是严重威胁着人们健康及生活质量的常见病之一。血脂异常以及血管内皮损伤被认为是冠心病发生的病理学基础。但随着病因学研究的深入,发现慢性炎症在冠心病的发生发展中也起着不容忽视的作用。泡沫细胞(Foam cells)的形成、粥样斑块(Atheromatous plaque)的蓄积则是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)发展的核心步骤。他汀类药物(Statins)作为抗AS的一线用药,能够有效的控制患者血脂水平。阿托伐他汀钙(Atorvastatin calcium,ATRO)是一种强效的脂溶性他汀类药物,被广泛的用于抗动脉粥样硬化的治疗。随着药物的应用,肝功指标升高、肌溶解等不良反应也不容忽视,其中以胆红素(Bilirubin)、转氨酶(Transaminases)升高的现象最为常见。胆红素通常被视为肝功的评价指标,随着越来越多的研究发现,作为两大内源性的抗氧化物之一,胆红素在消除氧自由基(Oxygen free radical)、抑制氧化应激(Oxidative stress)水平及炎症水平上更是需为重视。也有一些研究侧面的证实,胆红素能够直接干预AS的发展,但其详细机制及作用仍有待进一步深入探讨。因此,本研究旨在探讨他汀类药物引起胆红素升高的临床意义,分析胆红素水平与冠心病严重程度、相关危险因素之间的关系。利用细胞体外实验,探索内皮损伤以及泡沫细胞形成与胆红素水平的相关机制研究,探讨胆红素对动脉粥样硬化发生发展的可能机制,为临床应用提供更多的理论基础和实验依据。目的:1.探讨血清胆红素水平与冠心病严重程度之间的关系,以及血清胆红素水平与冠心病危险因素之间的相关性。同时,分析冠心病患者服用阿托伐他汀钙(Atorvastatin calcium,ATRO)引起胆红素升高与冠心病相关危险因素变化的关系。2.在体外通过分析,胆红素对脂肪酸诱导的血管内皮细胞氧化应激水平、炎症水平和细胞存活状态的影响,明确胆红素对血管内皮细胞损伤的保护作用。3.在体外利用胆红素干预泡沫细胞的形成,明确胆红素对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的具体影响。方法:1.按照严格的筛选,回顾性分析我院初诊冠心病患者276例。依据血胆红素水平,将患者分为高胆红素组(TBIL>15.9μM,97例)和低胆红素组(TBIL<15.9μM,179例),并采用Gensini评分系统评估冠心病严重程度。进一步,分析胆红素水平与冠心病严重程度、CRP、血尿酸的相关性分析。根据实际服用阿托伐他汀钙的剂量,分为20 mg/d组(158例)和40 mg/d组(118例),分析患者用药前后胆红素和冠心病相关危险因素的变化。2.分离和培养小鼠血管内皮细胞,并利用高浓度(200μM)的油酸(Oleic acid,OA)或棕榈酸(Palmitic acid,PA)诱导细胞氧化应激损伤,同时给予不同浓度胆红素,进行细胞计数,并检测内皮细胞丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、4-羟基壬烯醛(4-Hydroxy-2-Nonenal,4HNE)含量,以及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性。本部分研究主要确定胆红素对脂肪酸诱导血管内皮细胞氧化应激和死亡的保护作用。3.利用ox-LDL和LPS诱导THP-1细胞形成泡沫细胞,并给予胆红素,检测泡沫细胞内甘油三酯(Triglyceride,TG)含量;利用油红O及Bodipy 493/503染色观察泡沫细胞脂滴大小及数量。提取总蛋白,Western blot分析泡沫细胞内脂滴相关蛋白表达。最终,确定胆红素水平对泡沫细胞形成的具体影响。结果:1.冠心病患者血胆红素水平低于正常人群。冠心病组血清总胆红素、间接胆红素、直接胆红素水平均低于对照组,具有统计学意义(P<0.01);但冠心病组C反应蛋白、血尿酸水平明显高于对照组,具有统计学意义(P<0.01)。2.血清胆红素水平与冠心病严重程度负相关。采用Gensini评分系统评估冠心病的严重程度,并分析其与血清胆红素水平之间的关系。结果发现血清胆红素水平越高的患者,冠心病严重程度越轻。皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient)分析显示,患者血清总胆红素水平同CRP、血尿酸水平亦呈一定的负相关性。3.阿托伐他汀钙能够升高血清直接胆红素水平。收集患者服药前和服用阿托伐他汀钙(ATRO)后血清检测结果并进行分析,结果显示,患者服用20 mg/d和40 mg/d ATRO后,丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸转移酶、总胆红素、直接胆红素水平均显著性升高(P<0.05),但间接胆红素服药前后无显著性差异(P>0.05);冠心病相关危险因素CRP、血尿酸水平明显降低(P<0.05)。此外,服用20 mg/d和40 mg/d ATRO患者,血清胆红素、CRP、血尿酸、血压、BMI无明显差异(P>0.05),但服用40 mg/d ATRO患者血中高密度脂蛋白的升高,及低密度脂蛋白的降低水平均高于服用20mg/d的患者(P<0.05)。4.胆红素能够抑制脂肪酸诱导的血管内皮细胞氧化应激的损伤。我们在体外分离培养小鼠血管内皮细胞,实验结果发现,0.5μM胆红素能够有效抑制高浓度(200μM)油酸(Oleic acid,OA)和棕榈酸(Palmitic acid,PA)诱导的血管内皮细胞死亡。血管内皮细胞氧化应激水平结果显示,胆红素能够有效降低高浓度脂肪酸所诱导的血管内皮细胞内MDA、4HNE水平升高,并增加SOD活性(P<0.05),表明胆红素能够抑制高脂诱导的血管内皮细胞氧化应激水平。5.胆红素抑制泡沫细胞形成。利用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)和脂多糖(LPS)诱导THP-1细胞形成泡沫细胞,利用试剂盒检测细胞内脂质含量,发现胆红素能够降低泡沫细胞内TG含量(P<0.05),提示胆红素能够抑制脂质的蓄积。利用油红O和Bodipy 493/503染色,结果显示胆红素能够显著降低巨噬细胞内脂滴的数量和体积。同时,细胞氧化应激水平的检测结果显示,胆红素能够明显降低ox-LDL和LPS诱发的泡沫细胞内MDA和4HNE升高,升高SOD活性。这些结果表明,胆红素能够抑制巨噬细胞来源的泡沫细胞形成。结论:本研究发现冠心病患者血清胆红素水平明显低于正常人群,血清胆红素水平与冠心病的严重程度及相关危险因素存在负相关。阿托伐他汀钙能够增加患者血清胆红素水平,且与冠心病的危险因素的变化一致,比如CRP、血尿酸等。在体外实验中,证实了胆红素可以抑制脂肪酸诱导的内皮细胞氧化应激损伤,提高细胞存活率。同时,胆红素同样可以抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成。本研究有助于我们进一步了解胆红素在心血管保护中的作用以及机制,为动脉粥样硬化的治疗提供新的思路。