焦炉逸散物主要成分是多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs),是人类确切致癌物(G1),可以引起焦炉工职业性肺癌。端粒是人染色体末端DNA-蛋白复合体,与端粒结合蛋白一起保护染色体完整性,端粒长度可以反映染色体的早期损伤。本文拟探讨焦炉工人PAHs暴露、端粒长度及遗传易感性三类生物标志的联系。目的1探讨人外周血白细胞相对端粒长度(relative telomere length,RTL)与外暴露和尿代谢指标的相关性,并分析其影响因素,探讨端粒损伤的暴露生物标志。2结合端粒相关蛋白基因、c GAS/STING信号通路基因和编码mi RNA基因上的功能性多态位点及端粒调控基因的m RNA表达情况,探讨端粒损伤的分子机制及发掘易感人群。研究对象和方法1研究对象暴露组为河南某焦化厂工龄≥1年的焦炉工人544例,对照组为同期无职业性PAHs和其他毒物接触的正常人群238例。专业的调查员收集研究对象基本信息,主要包括有一般人口学特征和职业史。2研究方法用HPLC法测定4种尿OH-PAHs的浓度;索式提取法检测空气中焦炉逸散物的浓度,并采用HPLC法测定空气中16种PAHs的浓度。实时荧光定量PCR法测定人外周血白细胞DNA的RTL。采用q PCR法检测端粒相关基因m RNA表达水平;运用飞行质谱的分型技术对所选功能性及易感性SNP位点进行基因分型。3统计学分析Epi Data3.1软件录入数据,SPSS21.0软件进行统计学分析。对于定量资料,根据数据的分布类型来选择统计分析方法;定性资料用卡方检验比较组间的差异。适当的调整协变量后,协方差分析尿代谢指标和RTL的影响因素。用Spearman相关分析外暴露和尿代谢指标与RTL的相关性。适当的调整协变量后,协方差分析比较不同基因型个体间RTL的差异;多重线性回归分析RTL随突变型等位基因位点数量变化的趋势。运用Haploview和PHASE2.0.2生物信息学软件进行单倍型的分析。使用PLINK1.07软件分析基因多态位点与其m RNA表达水平的关联性。双侧检验,检验水准α=0.05。结果1焦炉工职业暴露情况及其影响因素16种PAHs各组分的浓度均呈炉底<炉侧<炉顶的递增趋势,但只有萘、蒽和苯并(k)荧蒽在三种采样地点的浓度差异有统计学意义(P<0.05);总PAHs浓度范围为4.90-699.38 mg/L。总累积暴露量、1-羟基芘、1-羟基萘、2-羟基萘和3-羟基菲在两组间有统计学差异(Z=22.093,P<0.001;Z=13.479,P<0.001;Z=3.240,P=0.001;Z=9.048,P<0.001;Z=13.752,P<0.001)。进一步协方差分析发现,暴露组中男性(4.63±1.14 pg/μg Cre)和吸烟者(4.75±1.13 pg/μg Cre)尿1-羟基芘浓度高于女性(3.88±1.00 pg/μg Cre)和非吸烟者(4.19±1.12 pg/μg Cre),差异有统计学意义(F=15.071,P<0.001;F=5.006,P=0.026);暴露组中吸烟者尿1-羟基萘(4.30±1.10 pg/μg Cre)要显著高于非吸烟者(3.86±1.26 pg/μg Cre)(F=7.822,P=0.006);暴露组中吸烟者尿2-羟基萘浓度(4.89±0.96 pg/μg Cre)高于非吸烟者(4.16±0.97 pg/μg Cre)(F=37.930,P<0.001),对照组中吸烟者尿2-羟基萘浓度(4.05±1.15 pg/μg Cre)显著地高于非吸烟者(3.17±0.82 pg/μg Cre)(F=11.401,P=0.001);暴露组男性尿3-羟基菲浓度(3.12±1.08 pg/μg Cre)高于女性(2.49±0.87 pg/μg Cre)(F=13.305,P<0.001)。2人外周血白细胞RTL的影响因素秩和检验表明,外周血DNA RTL暴露组0.75(0.51,1.08)显著短于对照组1.05(0.76,1.44)(Z=7.692,P<0.001)。数据转换后进行协方差分析显示,发现对照组中经调整后的RTL在高年龄组5.39(95%CI,5.16-5.62)显著地长于低年龄组4.74(95%CI,4.56-4.90)(F=13.385,P<0.001),吸烟组的RTL 5.24(95%CI,4.99-5.48)长于不吸烟组4.95(95%CI,4.84-5.05),差异有统计学意义(F=4.432,P=0.037)。Spearman相关分析发现,总累积暴露量、1-羟基芘、2-羟基萘和3-羟基菲与RTL呈显著的负相关(r=-0.307,P<0.001;r=-0.212,P<0.001;r=-0.110,P=0.025;r=-0.251,P<0.001)。3端粒相关基因多态及其m RNA表达水平对RTL的影响此通路29个SNP位点中发现8个位点对RTL有影响。校正影响RTL的协变量后,协方差分析显示,暴露组中携带TERT rs2736109位点突变纯合型AA个体RTL(4.86±0.96)长于野生纯合型GG(4.53±0.85)(P=0.024),对照组中此位点杂合型AG个体RTL(4.82±0.77)短于野生纯合型GG(5.14±0.67)(P=0.001);暴露组中携带TERT rs3215401位点插入突变纯合型CC个体RTL(4.81±0.81)长于野生纯合缺失型(4.54±0.82)(P=0.014);暴露组中携带TERT rs2736100位点杂合型GT个体RTL(4.63±0.80)长于野生纯合型TT(4.45±0.83)(P=0.028);对照组中携带TNKS rs1055328位点突变纯合型CC(5.02±0.71)和杂合型CG(5.08±0.68)个体RTL均长于其野生纯合型GG(4.54±1.01)(P=0.021;P=0.005);暴露组中携带TNKS rs9329202位点杂合型AG个体RTL(4.50±0.86)短于野生纯合型GG(4.72±0.79)(P=0.030);对照组中携带TEP1 rs1760897位点杂合型CT个体RTL(4.90±0.67)短于野生纯合型CC(5.28±0.60)(P=0.030);对照组中携带TEP1 rs1760903位点突变纯合型CC个体RTL(5.30±0.53)长于野生纯合型TT(5.00±0.75)(P=0.021);对照组中携带TEP1 rs1760904位点突变纯合型TT个体RTL(5.27±0.52)长于野生纯合型CC(4.98±0.75)(P=0.032)。趋势性检验显示,TERT rs3215401位点在暴露组中个体RTL随着基因型-/-→-/C→CC有递增的趋势(Ptrend=0.048);TERT rs2736100位点在暴露组中个体RTL随着基因型TT→GT→GG有逐渐增长的趋势(Ptrend=0.044);TEP1rs938886位点在对照组中个体RTL随着基因型CC→CG→GG有递增的趋势(Ptrend=0.014)。单体型分析的结果显示,TERT基因上的SNPs位点按rs3215401→rs2735940的顺序构成3种单体型,分析发现在暴露组中携带DT/CT(4.32±0.72)、DC/DC(4.48±0.79)和DC/CT(4.57±0.85)双体型个体RTL显著短于CT/CT双体型(4.83±0.81)(P=0.030;P=0.005;P=0.030);TNKS基因上的SNPs位点按rs17734024→rs1055328的顺序构成3种单体型,分析发现,在暴露组中携带GC/AC双体型个体RTL(4.47±0.81)显著短于GG/GG双体型(4.76±0.86)(P=0.026),在对照组中GC/GC(5.11±0.74)、GC/GG(5.03±0.71)和GG/AC(5.23±0.55)双体型个体RTL长于GG/GG双体型(4.54±1.01)(P=0.005;P=0.011;P=0.006);TEP1基因上的SNPs位点构成两个单倍型块,Block1中按rs938886→rs1713449的顺序构成4种单体型,分析发现对照组中携带CT/GC双体型个体RTL(4.90±0.75)显著短于GC/GC双体型(5.14±0.70)(P=0.011);TEP1基因上Block2按rs1760904→rs1760903的顺序构成4种单体型,分析发现,对照组中携带CT/CT(4.97±0.76)和CT/TC(4.84±0.78)双体型个体RTL均短于TC/TC双体型(5.29±0.51)(P=0.012;P=0.001)。暴露组中TPP1、TERF1和TERF2 m RNA的表达水平显著地低于对照组,有统计学差异(Z=8.396,P<0.001;Z=15.605,P<0.001;Z=2.679,P=0.007);暴露组POT1的m RNA表达水平高于对照组(Z=1.983,P=0.047)。Spearman相关分析发现,暴露组中TPP1和TERF2 m RNA表达水平与RTL呈负相关(r=-0.136,P=0.001;r=-0.103,P=0.016)。校正协变量后,在暴露组中发现TERF2基因m RNA的表达水平随着TERF2 rs153045最小等位基因位点C的增加而升高(β=0.100,P=0.023)。4 c GAS/STING信号通路基因多态性与RTL的关联性此通路8个SNP位点中发现仅有1个位点对RTL有影响。校正影响RTL的协变量后,协方差分析显示暴露组中携带c GAS rs34413328缺失型基因位点杂合型-/A个体RTL(4.42±0.85)短于野生纯合型AA(4.65±0.82)(P=0.006);趋势性检验发现,c GAS rs34413328位点在暴露组中个体RTL随着基因型AA→-/A→-/-有递减的趋势(Ptrend=0.008)。c GAS基因上的SNPs位点按rs610913→rs34413328的顺序构成4种单体型,经调整协变量后协方差分析发现,暴露组中携带AA/AA(4.71±0.74)和AA/CA(4.67±0.86)双体型个体RTL显著长于AA/CD双体型(4.42±0.83)(P=0.018;P=0.017),对照组中携带AA/CA双体型个体RTL(5.14±0.67)显著地长于AA/CD双体型(4.90±0.77)(P=0.016)。5编码mi RNA的基因多态性与RTL的关联性编码mi RNA的基因上15个SNP位点中发现6个位点对RTL有影响。校正影响RTL的协变量后,协方差分析显示,对照组中携带mi R-210 rs11246190位点杂合型AG个体RTL(5.06±0.71)长于野生纯合型AA(4.88±0.79)(P=0.026);暴露组中mi R-145 rs353291位点突变纯合型GG个体RTL(4.67±0.85)长于野生纯合型AA(4.51±0.78)(P=0.042);mi R-30a rs763354位点在对照组中野生纯合型AA个体RTL(5.26±0.58)长于突变纯合型GG(4.92±0.75)(P=0.018);对照组中携带mi R-30a rs111456995插入型位点突变纯合型TT个体RTL(5.12±0.71)长于缺失纯合型(4.81±0.73)(P=0.038);对于mi R-30a rs2222722基因位点,暴露组中杂合型CT个体RTL(4.66±0.83)长于野生纯合型TT(4.40±0.90)(P=0.008),在对照组中突变纯合型CC(4.87±0.73)和杂合型CT(4.95±0.78)个体RTL均短于野生纯合型TT(5.25±0.57)(P=0.007;P=0.010);在暴露组中mi R-197 rs1889470突变纯合型AA个体RTL(4.60±0.82)长于野生纯合型GG(4.29±1.04)(P=0.046)。趋势性检验发现,mi R-210 rs11246190基因位点在对照组中个体RTL随着基因型AA→AG有逐渐增加的趋势(Ptrend=0.026);mi R-145 rs353291位点在暴露组中个体RTL呈现随着基因型AA→AG→GG有递增的趋势(Ptrend=0.029);mi R-30a rs763354位点在对照组中个体RTL随着基因型GG→AG→AA有逐渐增加的趋势(Ptrend=0.045);mi R-30a rs111456995位点在对照组中个体RTL随着基因型-/-→-/T→TT有递增的趋势(Ptrend=0.017);mi R-30a rs2222722位点在对照组中个体RTL随着基因型TT→CT→CC有递减的趋势(Ptrend=0.017)。单体型分析的结果显示,mi R-210基因上的SNPs位点按rs7935908→rs7395206→rs12364149的顺序构成7种单体型,在对照组中,携带TTC/TTC(4.93±0.69)、TTC/CCC(5.12±0.80)、TTC/CCG(5.07±0.56)和CCG/CCG(5.19±0.57)双体型个体RTL显著长于TTC/TCC双体型(4.37±0.94)(P=0.011;P=0.002;P=0.004;P=0.011)。结论1.焦炉逸散物致人外周血白细胞RTL缩短。RTL随着1-羟基芘、2-羟基萘和3-羟基菲的浓度增加有变短的趋势,这三项指标可以作为PAHs暴露的生物学标志物。2.结合端粒长度的调节机制,端粒保卫蛋白复合体TPP1、TERF1、TERF2和POT1 m RNA表达水平可能与端粒长度有关。TERF2 m RNA的表达水平可能受TERF2 rs153045位点基因变异的影响。3.TERT rs2736109、TERT rs3215401、TERT rs2736100、TNKS rs9329202、c GAS rs34413328、mi R-145 rs353291、mi R-30a rs2222722和mi R-197 rs1889470位点的遗传变异影响了暴露工人的外周血基因组端粒长度。这些位点可能是焦炉逸散物致端粒损伤的易感性位点。