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研究背景脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS),是机体和病原体相互作用所引起的抗炎和促炎反应失衡的结果,其病原体可为细菌、病毒和真菌。疾病进一步加重可出现严重的脓毒症、脓毒症休克和多器官功能障碍(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。脓毒症相关性脑病(Sepsis associated encephalopathy,SAE)是脓毒症患者常见的并发症,脓毒症发生时,中枢神经系统(Central nervous system,CNS)被认为是最早遭受损伤的器官,其损伤可出现在多脏器功能不全之前,SAE具体的定义为脓毒症患者在排除中枢神经系统直接感染、结构异常或其他类型的脑病(如肺性脑病、肝性脑病)的情况下,所出现的弥漫性脑功能障碍[1]。目前脓毒症的患病率是千分之三,在这些脓毒症患者中约70%会出现SAE,SAE的发展和转归与患者的死亡率息息相关[2]。但是对于SAE的确切发病机制仍未明确,潜在的机制有血脑屏障的破坏、炎症因子损伤、氧化应激、小胶质细胞的激活等[3]。在脓毒症的患者中,由于自身免疫功能和耐受能力的下降,老年人已经成为脓毒症主要的患病群体,约58-65%的患者为老年人[4],他们的发病率和死亡率也较其他年龄段的患者有明显的增高。此外,在美国脓毒症已经成为65岁以上老年人死亡的第十大原因[5]。Angus的研究结果显示,85岁或以上的老年人在脓毒症的发病率是青少年的100倍,而死亡率是青少年的3.8倍[4]。最近的一项研究评估了老年人在严重脓毒症的长期死亡率,发现总的死亡率为55%,其中一年死亡率为30.6%,两年死亡率为43%,这就意味着接近一半的老年患者会在出院后三年内死亡,此外作者也指出脓毒症愈后出现的痴呆与其长期死亡率息息相关[6]。SAE会导致认知功能急性和慢性的改变,其中最容易检测到的是急性改变,表现为脑病和谵妄。然而,越来越多的研究证据表明在动物和人类中,SAE会导致长期的认知功能障碍。动物模型显示,在SAE后,他们长期的行为、学习和记忆力都有明显的变化[7]。海马神经元的损失被认为是长期记忆障碍的基础。在细胞实验中,脂多糖诱导的慢性炎症模型γ-氨基丁酸相关活动增加,海马神经细胞膜的兴奋性改变,这就进一步证明了SAE时海马突触功能出现了障碍。核转录因子κB(Nuclear transcriptrion factorκB,NF-κB)是广泛存在于真核细胞的转录因子,调节着多种细胞的功能,如细胞免疫、细胞凋亡、细胞分化和增殖[8-11]。NF-κB转录调节的位点是在许多炎症因子和免疫因子的启动区,因此对炎症反应的发展起着重要的作用。炎症因子在脑组织中过度表达使神经元存在的环境发生改变,使神经元变性[12,13]。目前NF-κB的活性抑制剂主要有吡咯烷二硫代氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)、抗炎因子IL-10、一氧化氮、糖皮质激素和非甾体类抗炎药物(水杨酸和阿司匹林)。研究表明PDTC是专一的NF-κB特异性抑制剂,能有效阻断NF-κB的信号通路[14]。PDTC通过降低DNA与NF-κB的结合能力、增加I-κB的合成、阻止NF-κB的两个亚基p50和p65转移到细胞核等方式来发挥抑制作用[15]。因为NF-κB控制着免疫和炎症的相关基因表达,而这些基因涉及到脓毒症、哮喘、中毒等多种疾病的进展,与多种疾病的转归密切相关,所以阻断NF-κB的激活是在一个炎症反应的上游来对总体的环节进行控制,是预防各个器官发生功能障碍的有效途径。通过抑制NF-κB的活化,PDTC能降低粘附因子和中性粒细胞的表达,减少炎症细胞的渗出与聚集,可有效减少炎症部位所释放的对组织有破坏作用的中性水解酶、过氧化物酶和酸性水解酶,从而减轻对人体的伤害[16]。因此,本研究旨在探讨多次小剂量LPS对不同年龄小鼠认知功能的影响,以及PDTC的干预效应,为SAE的治疗和预后提供依据,同时也为PDTC在SAE中的保护作用提供新的研究方向。研究目的1、观测脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)对不同年龄小鼠认知功能的影响2、探讨吡咯烷二硫代氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)对中枢炎症老年小鼠的干预效应研究方法1、青年雌性SPF级C57BL/6小鼠30只,6~8周龄,体重15-20g;老年雌性SPF级C57BL/小鼠60只,10~12月龄,体重20~30g。2、采用随机数字表法,将其分为6组(n=15);青年对照组(Y组)、青年LPS组(YL组)、老年对照组(O组)、老年PDTC对照组(P组)、老年LPS组(OL组)、老年PDTC治疗组(L+P组)。3、YL组和OL组腹腔注射LPS 250 ug/kg,1次/d,连续7d;L+P组每天于LPS注射前30min腹腔注射PDTC 50 mg/kg,1次/d,连续7d。4、末次给药后2h取血浆及海马组织,采用ELISA法测定血浆和海马中TNF-α、IL-1β、IL-6含量,同时对O组和OL进行肺组织的取材,行HE染色观察肺组织的病理改变。其余于末次给药24h后进行行为学检测,包括Morris水迷宫、旷场实验和高架十字实验,行为学结束后取脑组织行免疫组化和Western blot。结果1、肺组织HE染色结果显示,O组肺泡结构完整,肺泡腔无渗出、肺泡间隔无增宽、肺间质无炎症细胞浸润。与O组比较,OL组肺组织未见明显的病理学差异;2、与Y组比较,YL组在开臂时间百分比降低、进入开臂和闭臂次数减少,中央区活动时间降低(P<0.05);3、与O组比较,OL组开臂时间百分比降低、进入开臂和闭臂次数减少,中央区活动时间降低,逃避潜伏期增加、原平台所在象限停留时间减少、穿越平台次数减少,血浆和海马中TNF-α、IL-1β、IL-6含量增高(P<0.05);4、与OL组比较,L+P组开臂时间百分比升高、进入开臂和闭臂次数增加,中央区活动时间增加,逃避潜伏期降低、原平台所在象限停留时间增加,血浆和海马中TNF-α、IL-1β、IL-6含量降低(P<0.05);5、在免疫组化中,与O组比较,OL组在海马的小胶质细胞激活标记物IBA-1、Tau p T205和Aβ1–42的表达量明显增加;与OL组比较,L+P组在海马的小胶质细胞激活标记物IBA-1、Tau p T205和Aβ1–42的表达量明显降低;6、在Western blot中,与O组比较,OL组在海马Tau p S396、Tau p T205、NF-κB P65和Aβ1–42的表达量明显增加(P<0.05);与OL组比较,L+P组在海马Tau p S396、Tau p T205、NF-κB P65和Aβ1–42的表达量明显降低(P<0.05)。结论1、多次小剂量的LPS不能诱发青年小鼠认知功能障碍,却能诱发老年小鼠出现认知功能障碍。2、应用NF-κB特异性抑制剂PDTC干预LPS诱导的中枢炎症老年小鼠,能明显减少其外周和中枢炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的产生,减少小胶质细胞的激活、Aβ1–42的沉积以及Tau过度的磷酸化,改善认知功能障碍。