论文部分内容阅读
第一部分肾透明细胞癌缺氧相关lncRNAs的筛选及预后模型构建目的:缺氧是肾透明细胞癌的一个重要临床特征,并调节各种肿瘤发生发展过程。越来越多的证据表明,长非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）与肾透明细胞癌患者的生存结果密切相关,并调节缺氧诱导肿瘤的过程。因此,本研究旨在通过分析癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas database,TCGA）,筛选与肾透明细胞癌患者总生存期紧密关联的缺氧相关lncRNA分子,从而建立预后评估模型,用于预测肾透明细胞癌患者的生存结果。方法:1.肾透明细胞癌缺氧相关lncRNA分子筛选。从TCGA数据库下载肾透明细胞癌转录组数据,进一步分析提取出蛋白编码基因及lncRNA,以正常肾组织样本为对照,提取肾透明细胞癌中差异化表达的lncRNA进行后续分析。从分子特征数据库（the Molecular Signatures Database）下载缺氧相关基因。对肾透明细胞癌样本中差异表达的lncRNA和缺氧相关基因进行共表达分析,以确定缺氧相关lncRNA。2.肾透明细胞癌缺氧相关lncRNA预后模型构建。从TCGA下载肾透明细胞癌患者临床信息,将其随机分为一个训练集和三个验证集。在训练集中,将缺氧相关lncRNA纳入单因素和多因素Cox比例风险回归模型,以选择最佳lncRNA分子来构建用于预测肾透明细胞癌预后的缺氧相关lncRNA模型:Risk score（patient）=（?）（coef×exp）3.缺氧相关lncRNA模型验证。在验证集中,应用构建的lncRNA预后评估模型计算每个样本的风险值,根据中位风险值分为高低风险两组,通过绘制ROC曲线、Kaplan-Meier生存曲线评估预后预测价值。4.缺氧相关lncRNA模型临床应用探索。对风险值与肿瘤分期、分级进行相关性分析;将风险值、患者临床生物学特征共同纳入进行独立预后分析,筛选出影响肾透明细胞癌患者总生存期的独立预后因素,并构建列线图;分析患者风险值与肿瘤免疫微环境的关系。结果:1.从TCGA数据库筛选出14143个在肾透明细胞癌组织中差异化表达的lncRNA。从分子特征数据库筛选出137个缺氧相关基因。差异化表达lncRNA与缺氧相关基因进行共表达分析,共获取598个缺氧相关lncRNA（HRL）。2.将肾透明细胞癌患者按照1:1的比例随机分为训练集（n=255）和第一验证集（n=252）,再按照3:7的比例随机分为第二验证集（n=153）和第三验证集（n=354）。在训练集中,将598个HRL与预后进行相关性分析,筛选出163个预后相关HRL。经Lasso回归筛选变量后纳入多因素COX比例风险回归模型,构建包含9个缺氧相关lncRNAs（ITPR1-DT,AC008760.2,AC084876.1,AC002070.1,LINC02027,AC147651.1,FOXD2-AS1,LINC00944,LINC01615）的预后预测模型。3.在训练集中,应用本模型计算每个样本风险值,取中位风险值为最佳临界值,从而划分为高低风险两组。在预测肾透明细胞癌患者总生存期方面表现良好,验证集验证结果一致。4.该模型与肿瘤分级、分期以及肿瘤免疫浸润有关,且模型计算风险值、患者年龄、肿瘤分期、分级为肾透明细胞癌患者独立预后因素,用于构建列线图,可有效判断1、2、3年生存率。结论:本研究结果表明缺氧相关lncRNA评估模型可有助于预测肾透明细胞癌预后。此外,该模型中的lncRNA可能是研究肾透明细胞癌发生发展和设计个体化治疗策略的有效靶点。第二部分缺氧相关lncRNA FOXD2-AS1参与肾透明细胞癌增殖侵袭的相关分子机制研究目的:基于第一部分肾透明细胞癌中缺氧相关lncRNA分子筛选及其预后模型的构建,我们进一步对模型中纳入的lncRNA分子功能及作用机制进行了进一步探索,重点探讨FOXD2-AS1在肾透明细胞癌增殖的功能及分子生物学机制。方法:1.首先运用GEPIA软件预测FOXD2-AS1在肾透明细胞癌组织及正常肾脏组织中是否存在差异化表达,以及其表达量与生存的关系。2.观察FOXD2-AS1在肾透明细胞癌细胞系中差异化表达及生物学行为。采用逆转录-实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测FOXD2-AS1在肾透明细胞癌细胞系中的表达情况。慢病毒转染肾透明细胞癌细胞构建FOXD2-AS1干扰和过表达稳定转染细胞株,行CCK-8、EDU、平板克隆、transwell迁移及侵袭等体外细胞实验探索FOXD2-AS1的表达对肾透明细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭功能的影响。皮下注射干扰FOXD2-AS1肾透明细胞癌细胞及对照肾透明细胞癌细胞,体内动物实验构建裸鼠皮下成瘤模型,测量肿瘤体积及生存曲线,探索FOXD2-AS1的表达对肾透明细胞癌细胞增殖功能的影响。3.探索FOXD2-AS1调控肾透明细胞癌增殖的分子生物学机制。筛选FOXD2-AS1下游微小RNA206（micro RNA206,mi R-206）,构建FOXD2-AS1干扰和过表达稳定转染细胞株,通过双荧光素酶实验验证FOXD2-AS1与mi R-206的竞争性结合关系。4.筛选mi R-206下游靶基因血管内皮生长因子A（Vascular endothelial growth factor,VEGFA）,双荧光素酶实验检测mi R-206与VEGFA关系。干扰或过表达FOXD2-AS1,western blot（WB）检测VEGFA表达。回复实验过表达FOXD2-AS1并共转mi R-206 mimics后,WB检测VEGFA表达变化,CCK-8、平板克隆、transwell迁移及侵袭实验检测肾透明细胞癌细胞功能增殖、迁移及侵袭功能。结果:1.GEPIA软件显示lncRNA FOXD2-AS1在肾透明细胞癌组织高表达,且与患者不良预后密切相关。2、qRT-PCR显示FOXD2-AS1在肾透明细胞癌细胞系KTCTL-140及RCC23中较人肾皮质近曲小管细胞系HK-2高表达。FOXD2-AS1干扰后,肾透明细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭功能明显受抑。FOXD2-AS1过表达后,肾透明细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭功能明显增强。动物实验显示干扰FOXD2-AS1后肾透明细胞癌肿瘤生长速度减慢。3、构建FOXD2-AS1干扰和过表达稳定转染细胞株,双荧光素酶实验证实FOXD2-AS1与mi R-206具有竞争性结合关系。4、过表达FOXD2-AS1,VEGFA表达上调,而干扰后FOXD2-AS1,VEGFA表达下调。双荧光素酶实验证实mi R-206与VEGFA存在结合关系。回复实验过表达FOXD2-AS1并共转mi R-206 mimics后,FOXD2-AS1对VEGFA的调控作用及对肾透明细胞增殖、侵袭作用可被mi R-206 mimics回复。结论:本研究结果显示在肾透明细胞癌细胞中,FOXD2-AS1可通过竞争性结合mi R206,调控VEGFA表达,进而促进肾透明细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭。