苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)制剂是一种应用广泛的生物杀虫剂,但是它也存在一些缺陷。比如,在田间施用时易受到太阳光中紫外线的照射而失活,需要重复喷洒,造成了使用价格偏高。黑色素具有抗紫外、抗辐射的功能,能够起到保护Bt杀虫剂的作用。但是,目前能够产生黑色素的Bt菌株极少,且其产生黑色素途径也没有明确;应用黑色素制备光保护功能的Bt杀虫剂还未得到实际应用。因此,对Bt产黑色素途径的研究是非常有必要的。野生菌株Bt L-7601和突变菌株Bt BMB181都能够在普通LB液体培养基中产生黑色素,Bt BMB171是突变菌株Bt BMB181的原始菌株,Bt HD73是可以产生杀虫晶体蛋白Cry1AC的原始菌株,本研究选取这四株菌株为黑色素途径的研究对象。本研究选用三种产黑途径中的关键酶抑制剂进行酶抑制剂实验,结果显示,只有添加了HGA途径中对羟基苯丙酮酸羟化酶(HppD)的抑制剂时,Bt L-7601和Bt BMB181才会丧失产黑能力。在大肠杆菌中异源表达hppD基因和hppD操纵子,结果表明,Bt L-7601、Bt BMB171和Bt BMB181的hppD基因都可以引起黑色素的积累,但是只有Bt BMB171的尿黑酸1,2-二氧化酶(HmgA)可以发挥正常功能,Bt L-7601和Bt BMB181的hmgA都无法降解尿黑酸,引起黑色素积累。通过对Bt L-7601进行全基因组测序和分析,我们发现Bt L-7601的hmgA基因发生了移码突变,引起了该基因在Bt L-7601中提前终止。我们推测该基因的突变造成尿黑酸积累,进而聚合成黑色素,所以其产黑途径可能是HGA黑色素合成途径。对比Bt BMB181和Bt BMB171中的hmgA基因,发现前者的基因存在一个点突变(815G→A),引起了氨基酸突变(G272E)。另外,体外对Bt BMB171和Bt BMB181的HmgA进行酶活测试,结果显示Bt BMB171的HmgA酶活比Bt BMB181的高十倍以上。在Bt BMB181中强表达Bt BMB171或Bt BMB181的hmgA基因,新构建菌株都丧失了产生黑色素能力,所以Bt BMB181产黑途径可能也是HGA黑色素途径。为了确定Bt中的黑色素合成途径,本研究应用CRISPR/cas9技术敲除了Bt BMB171和Bt HD73的hmgA基因。结果显示,敲除菌株获得了产生黑色素的能力,而回补菌株又恢复了原始菌株的表型。突变菌Bt HD73△hmgA在芽胞的形成效率、杀虫晶体蛋白Cry1AC的形态和蛋白产生量上和原始菌株没有明显差别。本研究还发现在马来酰乙酰乙酸异构酶(MaiA)缺失的情况下,Bt BMB171的FahA仍然可以降解马来酰乙酰乙酸,而添加了铜绿假单胞菌的MaiA后马来酰乙酰乙酸的降解明显加快。表明在Bt菌株中缺少MaiA仅会降低尿黑酸降解效率,但不会造成尿黑酸无法降解。