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克氏原螯虾(Procambarus clarkii)隶属甲壳纲(Crustacea)、十足目(Order Decapoda)、爬行亚目(Reptantia)、螯虾科(Cambaridae)、原螯虾属(Procambarus),又称淡水小龙虾或红螯虾。由于其肉质鲜香、营养成分高,且价格低廉,已成为我国一种重要的水产资源,具有较高的营养价值和经济价值。随着克氏原螯虾消费需求日益增加,市场供不应求,然而人工饲养克氏原螯虾却面临着优质虾苗不足,性早熟,低产卵量,低孵化率和幼虾成活率不高等问题,优质虾苗的缺乏成为制约克氏原螯虾养殖产业发展的主要因素,要解决这一问题,有赖于深入了解克氏原螯虾卵巢及胚胎发育的分子调控机理。当前,对于克氏原螯虾卵巢和胚胎发育的研究主要集中在生理学和组织形态学方面,而对发育过程中的分子调控机制研究甚少。本研究首先以克氏原螯虾的卵巢为材料,利用转录组测序技术对次级卵黄发生时期卵巢的转录组进行了测序和分析,然后我们对筛选得到的推测与克氏原螯虾发育过程相关基因视黄醇脱氢酶13(retinol dehydrogenase 13,RDH13)在发育过程中的功能进行了较为系统的研究。实验结果如下:本研究对克氏原螯虾卵巢进行转录组测序,得到9.28Gb数据,将所得序列进行拼接组装,共得到69,261条Unigene,Unigene的N50为1,129bp。将拼接所得的序列与公共数据库进行同源性搜索、比对和功能注释,共获得24,014条Unigene的注释结果。通过GO分类分析得到11,436条注释结果,基因功能主要包含在细胞组分、分子功能和生化过程中。通过KOG分类,共有17,007条序列被注释到25个功能类群中,其主要基因的功能的类别为一般的功能预测基因,信号转导机制,翻译后加工并协助蛋白质折叠的伴侣蛋白,翻译中核糖体的构成及生物转化。基于转录组测序文库,利用Blastx及生物信息学手段初步筛选得到推测与克氏原螯虾发育过程相关基因RDH13的序列片段,并对其在克氏原螯虾发育过程中的功能进行了较为系统的研究。首先对RDH13基因序列进行分析,发现含有RDH家族典型的adh_short结构域,多重序列比对结果显示,该基因的氨基酸序列与湿木白蚁RDH11的相似性最高,达到38.64%。QRT-PCR分析表明,RDH13在卵巢中特异性表达,且在次级卵黄发生时期有更高的表达水平(P<0.05)。原位杂交结果显示,RDH13的mRNA在克氏原螯虾发育早期围绕卵母细胞的滤泡细胞和相对成熟时期卵母细胞的细胞质中表达。其次利用RNAi技术敲降掉RDH13基因,卵巢中卵黄蛋白原(Vg)和卵黄蛋白原受体(VgR)的表达量均显著下降(P<0.05),推测RDH13对卵黄蛋白原的吸收和加工有重要作用,从而促进卵子发生过程。最后外源性的孕酮注射72h后,卵巢中RDH13的表达量显著增加(P<0.05),VgR的表达量在孕酮注射6h后显著下调(P<0.05),推测孕酮可能通过调控RDH13的表达功能性地参与克氏原螯虾的卵巢发育。以上结果表明RDH13的表达可受孕酮的调控,并对克氏原螯虾的卵巢发育起重要作用,可能帮助卵黄蛋白原的吸收和加工,从而促进卵子发生。QRT-PCR分析表明,RDH13在受精卵、卵裂期和无节幼体后期大量表达,其他时期微量表达(P<0.01)。为进一步探究DDH13在胚胎发育过程发挥的作用,利用RNAi技术通过胚胎浸泡法敲降RDH13基因,卵裂期敲降掉RDH13基因,胚胎不能完成正常的卵裂,在原肠期前后胚胎大量死亡。以上结果表明:RDH13在胚胎早期大量表达,可能是母源性的,胚胎早期基因干扰实验表明,其在早期胚胎发育阶段起重要作用。综上所述,本研究首次对克氏原螯虾卵巢进行了转录组测序并对测序所得数据进行了分析,为后续的克氏原螯虾分子生物学相关研究提供了大量序列信息。更进一步对RDH13基因在克氏原螯虾的卵子发生和胚胎发育过程中的功能进行了研究,为克氏原螯虾发育过程中的分子调控机制提供了重要的研究资料,也可为其他甲壳动物的基础研究和遗传育种研究提供参考数据,具有重要的科学价值和现实意义。