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碱基切除修复（Base excision repair,BER）一般用于识别和修复发生于DNA碱基水平的损伤或异常修饰。典型的BER过程首先由特异性的DNA糖基化酶识别和切除受损碱基,形成一个无嘌呤或无嘧啶位点（AP位点）,然后由AP核酸内切酶切割AP位点5’端第一个磷酸二酯键形成3’-OH和5’-脱氧核苷磷酸（5’-dRP）,随后由核酸酶、DNA聚合酶及连接酶完成损伤片段的移除、新链的合成及连接。AP核酸内切酶可分为ExoⅢ和EndoⅣ两个家族,其生化性质的区别是ExoⅢ除具有AP核酸内切酶活性外一般还有3’-5’核酸外切酶活性。以人类中ExolⅢ家族蛋白Ape 1、Ape2,酿酒酵母中Apn1（EndoⅣ）、Apn2（ExoⅢ）及大肠杆菌中EcoExoⅢ和EcoEndoⅣV为代表,源于真核生物和细菌的两个家族的AP核酸内切酶同源蛋白的性质、结构和功能已得到全面的研究和鉴定。在古菌中,EndoⅣV家族同源蛋白保守分布,而ExoⅢ家族同源蛋白仅在部分物种中存在。尽管目前已有少数广古菌包括闪烁古生球菌Archaeoglobus fulgidus、热自养甲烷杆菌Methanobacterium thermoautotrophicum等及泉古菌耐超高温热棒菌Pyrobaculum aerophilum中的AP核酸内切酶得到初步鉴定,但相关研究均集中于蛋白的体外生化性质分析,体内功能的研究仍十分匮乏。冰岛硫化叶菌Sulfolbus islandicus是古菌中少数既有ExoⅢ也有EndoⅣ家族同源蛋白的物种,且已具备完善的遗传操作体系,因此本论文首先围绕SisExoⅢ和SisEndoⅣV的体外生化性质和体内功能研究来展开。我们分别克隆和表达了 SisExoⅢ和SisEndoⅣ蛋白,以人工合成的含AP位点的寡核苷酸链为底物检测了其活性,发现二者均具有明显的AP核酸内切酶活性,但均没有3’-5’核酸外切酶活性;对其最适反应条件的摸索发现SisExoⅢ和SisEndoⅣ的最适pH均为9.5,最适二价金属离子为Mn2+。在此条件下我们比较了其酶学常数,SisExoⅢ和SisEndoⅣV的Km值并无显著差别但SisEndoⅣ的转换数Kcat约为SisExoⅢ的28倍,说明前者具有更高的催化效率。不同于其它已知的古菌来源的AP核酸内切酶,SisExoⅢ和SisEndoⅣ对修饰型碱基如dl、dU及8-oxo-dG均没有切割活性。为了进一步探究两个AP核酸内切酶在硫化叶菌体内的功能定位,我们又对其进行了遗传分析。在前期实验的基础上我们相继获得了SiRe—0100（编码SisExoⅢ）和SiRe2666（编码SisEndoⅣ）的单敲和双敲菌株,损伤剂敏感性实验表明△SiRe0100并无明显表型,而△SiRe2666对烷化剂MMS敏感,暗示着SisEndoⅣ是硫化叶菌碱基切除修复途径中起主要功能的蛋白。对阿拉伯糖诱导下SisEndoⅣ的体内过表达分析发现菌株对MMS敏感性也有显著增强,而即使是蔗糖诱导下的低水平过表达也无法回补△SiRe—2666的敏感性,这表明严格调控SisEndoⅣ的体内表达水平对硫化叶菌碱基切除修复是必要的。我们还发现蔗糖诱导下SisExoⅢ的过表达可部分回补△SiRe2666的表型,说明限制其体内功能的原因可能为其较低的酶活力或表达水平。结合体外实验我们确认了SisEndoⅣV是硫化叶菌碱基切除修复中起主要功能的AP核酸内切酶,而SisExoⅢ可能只是候选蛋白。为了深入据了解SisExoⅢ对AP位点的催化机制,我们解析了 SisExoⅢ（Y105A）的晶体结构。我们发现尽管SisExoⅢ整体结构与本家族其它蛋白相类似,但在活性中心关键氨基酸残基的构架以及外围DNA结合区的柔性方面有很大差异,这可能是导致SisExoⅢ较弱的AP核酸内切酶活性和缺乏外切酶活性的原因之一。我们还发现Cys142和Cys215可形成一个分子内二硫键,该二硫键仅在泉古菌ExoⅢ同源蛋白中存在,对其进行突变分析表明二硫键的形成可促进蛋白在高温下的热稳定性。Holliday junction解离酶是能够特异性识别同源重组修复中间产物Holliday junction（HJ）的一类结构特异性核酸酶,它可介导HJ的resolution修复途径,在HJ双链上对称地切割产生切口,从而可使下游DNA连接酶直接连接完成修复。目前已知的HJ解离酶包括来自细菌中的RuvC及真核生物中的Mus81-EME1/Mms4、Slx1-S1x4及Gen1/Yen1,其中真核生物可通过磷酸化修饰对多个解离酶的活性、互作关系及亚细胞定位进行调节,从而在不同时期维持同源重组修复的高效进行。古菌中除了保守存在的HJ解离酶Hjc外,在极少数泉古菌中还存在另一个高效的解离酶Hje。遗传学分析表明Hje是冰岛硫化叶菌中起主要功能的解离酶,但尚不清楚其是否存在类似真核生物解离酶的磷酸化修饰调控机制。在前期研究的基础上本文对冰岛硫化叶菌中Hje蛋白的体外磷酸化修饰及功能进行了研究。我们发现SiRe2056编码的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶的羧基端催化结构域可在体外磷酸化Hje,修饰位点包括Ser30、Ser127及Thr134等。对磷酸化的Hje进行生化性质的分析发现其HJ结合活性略有降低。为研究Hje磷酸化修饰的体内功能,我们分别对Hje的Ser127和Thr134进行原位突变,将Ser127和Thr134突变为丙氨酸以造成磷酸化缺陷的菌株呈现对羟基脲（Hydroxyurea HU）敏感性的增强,而将其突变为谷氨酸以模拟磷酸化状态可使菌株对HU敏感性降低。考虑到Ser127和Thr134位于Hje蛋白远离活性中心的羧基末端,我们推测该位点的磷酸化可能影响了 Hje与其它修复因子的相互作用。对Hje磷酸化修饰的研究丰富了硫化叶菌同源重组修复的调节机制,同时可为其它古菌中修复蛋白的调控提供借鉴。