肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)是普遍存在于动物肌肉中的胰蛋白酶类似物。由于MBSP结构与功能间的作用缺乏深入研究,本文对鲫鱼MBSP的底物特异性进行分析,探讨并完善酶结构与功能间的关系,以拓展应用价值。以鲫鱼MBSP为对象,利用基因重组构建8株突变酵母表达菌株SMD1168-pPICZαA-t MBSP,表达产物分别命名为D170S、D170T、D170K、S171A、G193A、G203A、D170T/G203A、G193A/G203A。利用本实验室制备的兔抗鲫鱼MBSP多克隆抗体进行Western blot鉴定,确认重组表达产物为鲫鱼MBSP。利用荧光底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA(BFSR)、Boc-Gln-Arg-Arg-MCA(BQRR)、Boc-Glu-Lys-Lys-MCA(BEKK)和Boc-Val-Leu-Lys-MCA(BVLK)进行酶活力测定,仅4个突变体具酶活力(S171A、G193A、G203A、G193A/G203A)。底物特异性研究结果表明,与野生型MBSP的最适底物BQRR相比,突变体G193A与G193A/G203A无明显变化;突变体S171A的最适底物同为BQRR,但仅能水解BQRR、BFSR,不能水解BVLK、BEKK;突变体G203A的最适底物变为BEKK,且明显偏向于切割含Lys残基的底物。因突变体S171A专一的底物特异性,故对其进行深入分析。圆二色谱、同源建模结果显示,Ser171突变对MBSP的结构稳定性影响不大;分子对接分析结果显示,与野生型MBSP不同的是,底物BVLK、BEKK与突变体S171A的对接能量值由负值变为正值,且BVLK、BEKK作用区域彻底偏离酶分子的催化三联体与特异性底物结合口袋。由于底物与突变体S171A的作用区域发生变化最终导致突变体S171A只能选择性切割Arg残基,间接提示MBSP的催化三联体与特异性底物结合口袋在酶水解底物时发挥重要作用。MBSP是使鱼糜制品发生凝胶劣化的原因之一。本文选择两种胰蛋白酶抑制剂对MBSP进行抑制动力学分析,结果显示两种抑制剂对MBSP的抑制关系均属于可逆的竞争型抑制。因此MBSP能够被胰蛋白酶抑制剂抑制,从而在鱼糜制品加工过程中缓解凝胶劣化现象。其次,比较分析MBSP与胰蛋白酶对全蛋白的酶解情况,发现拟穴青蟹主要过敏原均能被MBSP降解,包括耐胰蛋白酶消化的精氨酸激酶。相比于胰蛋白酶及野生型MBSP,突变型MBSP的消化速率最快,仅在1 min就能将精氨酸激酶酶解成小分子片段。综上所述,MBSP经分子改造后,其突变体结构稳定性不变。分子对接技术结果模拟出突变体S171A与底物的作用区域发生变化,而导致突变体S171A底物特异性的变化。本研究中MBSP表达量较高且热稳定性较好,制备较为容易,有望替代商品化的胰蛋白酶。