目的:疟疾是一种虫媒传染病,病原体是疟原虫,可经雌性按蚊叮咬传播。感染疟疾后会出现高热、大汗、神昏头痛等症状,且发作呈现周期性,反复多次发作可能会导致脾肿大或者贫血,严重影响人类健康。疟疾在全球尤其是东南亚和非洲等地流行,造成每年数亿的发病和数十万的死亡,对抗疟疾的脚步不容放松。在消除疟疾道路上的一块绊脚石是疟原虫对各类抗疟药耐药性的产生和扩散。青蒿素复方疗法是世界卫生组织推荐的一线抗疟方案,由一种青蒿素类药物如青蒿素或其衍生物双氢青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚配伍一种半衰期较长,发挥作用较缓慢的药物如哌喹组成复方,既能提高疗效,又可以延缓耐药性的产生。青蒿素是我国医药工作者挖掘中医药宝藏的成果,青蒿素配伍哌喹制成的Artequick(ATQ)治疗疟疾是中医药防治重大疾病的成功实践。然而,近年来,东南亚部分地区陆续出现了疟原虫对青蒿素复方敏感性下降的情况,使得对青蒿素及青蒿素复方中的组分药物的抗性机制研究显得更为迫切。本课题以研究疟原虫对青蒿素产生抗性的分子机制为目的,在鼠疟模型上进行疟原虫对青蒿素和哌喹的抗性培育,观察不同药物耐药性产生的先后及抗性程度的差异;对具有一定抗性的青蒿素和哌喹抗性株进行基因测序,探索基因突变与药物耐药性的关系。方法:1.用昆明小鼠建立鼠疟模型,用药物剂量递增法对伯氏疟原虫K173株进行对青蒿素和哌喹的抗性培育,在本实验室已经进行的抗性培育20代的基础上继续培育至50代。在抗性培育过程中,每隔5代进行一次抗性指数的测定,抗性指数的测定采用Peters4天抑制实验,根据测得的抗性指数的高低和培育过程中对感染率的监控,适时调整用药剂量,但保证剂量不低于前一次抗性指数测定的代数抗性培育时所用的剂量。分析抗性培育情况。2.在抗性培育过程中,在每代抗性培育结束后,小鼠取全血,并从采集的小鼠全血中进行DNA的提取,后对疟原虫抗性株进行Kelch13(K13)片段的聚合酶链式反应(PCR),PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认后,进行基因测序。3.昆明小鼠40只,雌雄各半,适应性培养一周后随机分为四组,分别感染伯氏疟原虫K173敏感株,记为K173组;伯氏疟原虫K173对青蒿素抗性培育30代抗性株,记为A30组;伯氏疟原虫K173对青蒿素抗性培育50代抗性株,记为A50组和伯氏疟原虫K173对哌喹抗性培育50代抗性株,记为P50组,之后每天取小鼠尾血涂薄血片镜检监测感染率增长情况,当感染率达到1.5%时,摘眼球采血,收集血清用于小鼠磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)含量测定,收集血中疟原虫,提取脂质,用于测定疟原虫磷脂酰肌醇-3-磷酸PI(3)P含量,比较各组之间差异。结果:1.抗性培育进行至50代,疟原虫对青蒿素和哌喹均表现出一定抗性:疟原虫对青蒿素抗性培育从21代开始至50代,用药剂量从574.20mg/kg增加到883.96mg/kg,抗性指数从20代时的5.8增长至30代时12.37,但之后抗性指数又有下降,从40代至50代一直在5左右波动,50代时,抗性指数为4.97;疟原虫对哌喹的抗性培育用药剂量从21代时47.67mg/kg增加到50代时76.82mg/kg,抗性指数略有波动但整体呈上升趋势,50代时,达到148.82。2.对伯氏疟原虫K173敏感株及疟原虫对青蒿素和哌喹抗性株均进行K13片段的扩增和测序,测序结果与ENA中的伯氏疟原虫K173株K13片段的序列(CXJ03505.1)比对,敏感株未发现碱基变化,抗性株发现了超过30处基因突变,其中错义突变共9处,分别为 A128T、A189G、A311G、G361A、A368G、G398A、A464G、A531T 和 C1643T,对应的氨基酸变化为 Y43F、I63M、N104S、A121T、N123S、S133N、N155S、E177D 和S548L,其余为沉默突变。3.经测定,小鼠血清PI3K含量分别为:K173组为82.67±15.09 pmol/L,A30组为 84.33±19.39pmol/L,A50组为 109.27±10.13pmol/L,P50组为 99.54±10.98pmol/L。A50组小鼠PI3K含量高于K173组和A30组小鼠PI3K含量,差异有统计学意义(P<0.05),对于疟原虫PI(3)P含量,与敏感株相比,青蒿素抗性株疟原虫PI(3)P含量有升高,而哌喹抗性株疟原虫PI(3)P含量有下降,差异无统计学意义。结论:1.在抗性培育过程中,伯氏疟原虫K173株对青蒿素的抗性增长缓慢且常有波动,对哌喹的抗性整体呈持续快速上升趋势,最终得到了对青蒿素和哌喹表现出抗性的抗性株。2.在持续的药物压力下,疟原虫的K13片段发生了多处基因突变,其中有9处错义突变。青蒿素和哌喹引起了疟原虫K13片段相同的突变。3.包含有K13片段基因突变的疟原虫青蒿素抗性株感染小鼠后宿主血清PI3K含量及疟原虫PI(3)P含量升高,可能与青蒿素的抗性机制相关。