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研究背景随着科技进步,人们生活水平的提高,糖尿病已成为威胁人类健康的一个严重的全球性卫生问题。大型流行病学调查结果显示,糖尿病与年龄密切相关,好发于老年人,尤其是60岁以上老年人患病率较高。近年来,关于胰岛β细胞衰老在糖尿病发病机制中的作用备受关注,清除衰老细胞和改善衰老细胞的微环境有望成为糖尿病治疗方式之一。研究表明,细胞衰老分为复制性衰老和应激性衰老,氧化应激是导致细胞衰老的重要原因之一。在氧化应激过程中,硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)作为一种在细胞中广泛存在的氧化还原酶,可以减少氧化蛋白,清除自由基。硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)是唯一的Trx内源性结合抑制蛋白,抑制Trx活性,进而诱导氧化应激。有研究表明,在糖尿病患者和糖尿病模型小鼠中均观察到胰岛β细胞TXNIP的表达显著上调,且抑制TXNIP的表达可以减缓糖尿病的发生发展。细胞的增殖能力下降是细胞衰老的主要表现,因此我们推测TXNIP在糖尿病在发生发展过程中可能存在表达增多,进而促进胰岛β细胞衰老,减弱其增殖能力,引起β细胞更新不足,数目下降。除抑制Trx外,研究发现,TXNIP具有阻抑蛋白特征,通过与某些关键蛋白的结合而调节细胞活动。因此,TXNIP的作用机制存在Trx依赖和Trx非依赖的机制。那么TXNIP又是通过什么途径影响胰岛β细胞衰老的?因此,在本研究中,我们首先观察糖尿病鼠胰腺组织中TXNIP的表达,以及衰老的变化。并利用慢病毒载体,构建TXNIP过表达的INS-1胰岛β细胞株,模拟糖尿病时TXNIP表达上调,以分析TXNIP本身对胰岛β细胞老化的影响;同时构建半胱氨酸247位点突变的TXNIP过表达INS-1细胞株,以分析TXNIP依赖与非依赖Trx途径对胰岛β细胞衰老影响及可能存在的机制。构建TXNIP沉默INS-1细胞株,进一步确定TXNIP在胰岛β细胞衰老过程中的作用。第一部分:糖尿病促进胰腺TXNIP表达升高及衰老目的:糖尿病中可观察到胰岛β细胞中TXNIP表达升高,而TXNIP具有促凋亡、促炎和抑制增殖等作用。本部分旨在观察糖尿病小鼠胰腺组织TXNIP表达的变化以及胰腺组织衰老情况。方法:1.检测db/m、db/db小鼠空腹血糖值。2.Western blot检测胰腺组织TXNIP蛋白以及衰老相关指标p16,p21,Rb表达。3.β-半乳糖苷酶染色检测胰腺组织衰老细胞数。结果:对比db/m小鼠,db/db小鼠胰腺组织TXNIP蛋白表达升高,衰老相关蛋白p16、p21、Rb表达升高,衰老阳性细胞数增多,促进细胞衰老。结论:糖尿病小鼠中TXNIP表达上调,胰腺组织衰老增加。第二部分:慢病毒转染INS-1胰岛β细胞构建TXNIP过表达及干扰稳转细胞株目的:在大鼠INS-1胰岛β细胞中,通过慢病毒载体介导的转染方法构建稳定高效的TXNIP过表达及沉默模型。方法:1.构建含有绿色荧光蛋白(GFP)的空慢病毒载体(Ad-GFP)、TXNIP过表达慢病毒载体(Ad-TXNIP-GFP)及TXNIP半胱氨酸247位点突变过表达慢病毒载体(Ad-TXNIP-c247s-GFP)。2.构建含有红色荧光蛋白(merry)的空慢病毒载体(Scramble Sh-RNA)和TXNIP沉默慢病毒载体(TXNIP Sh-RNA-1、TXNIP Sh-RNA-2、TXNIP Sh-RNA-3)。3.Normal组直接加入1ml RPMI 1640完全培养基,Ad-GFP、Ad-TXNIP-GFP、Ad-TXNIP-c247s-GFP、Scramble Sh-RNA、TXNIP Sh-RNA-1、TXNIP Sh-RNA-2、TXNIP Sh-RNA-3各组分别加入30μl对应病毒与1ml RPMI 1640完全培养基的混合液。慢病毒转染4h后,弃去含病毒的培养基,1ml PBS洗3次,各组分别加4ml RPMI1640完全培养基,培养48h后,加入含3μg/ml嘌呤霉素(puromycin,PM)的RPMI 1640完全培养基进行抗性筛选,持续7天,每2~3天替换新的筛选培养基,运用荧光显微镜进行观察,当细胞荧光率达90%以上时,各组换回正常RMPI 1640完全培养基,稳转TXNIP沉默和过表达细胞株构建成功。4.荧光显微镜下观察各组荧光蛋白表达情况。5.Real-time PCR检测TXNIP m RNA表达水平。6.Western blot检测TXNIP蛋白表达水平。7.免疫共沉淀验证c247s位点突变的TXNIP过表达能否与Trx结合。结果:1.荧光显微镜下观察到稳转细胞株构建成功。2.与Ad-GFP组相比,Ad-TXNIP-GFP组TXNIP的m RNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。3.筛选有效TXNIP沉默序列,与Scramble Sh RNA组相比,第三条干扰序列效果最佳,其TXNIP的m RNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。4.半胱氨酸247位点突变的过表达TXNIP不能与Trx结合。结论:慢病毒载体稳转TXNIP过表达及沉默细胞株构建成功。第三部分:TXNIP对INS-1胰岛β细胞衰老的影响目的:观察TXNIP上调是否可以促进胰岛β细胞衰老,并探讨其可能机制。方法:1.采用慢病毒构建TXNIP过表达(Ad-TXNIP-GFP)、247位点半胱氨酸突变为丝氨酸的TXNIP过表达(Ad-TXNIP-c247s-GFP,丧失与硫氧还蛋白Trx结合位点)及沉默TXNIP(TXNIP Sh-RNA)稳转INS-1胰岛β细胞株。2.β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老。3.Western blot检测衰老相关基因p16、p21、Rb蛋白表达水平。4.Western blot检测p38 MAPK磷酸化、p53蛋白表达。结果:1.TXNIP及TXNIP-c247s过表达可促进p38 MAPK的磷酸化、p53蛋白表达,TXNIP沉默可抑制p38 MAPK的磷酸化、p53蛋白表达。2.分别采用p38 MAPK抑制剂SB203580、p53抑制剂Pifithrin-β预处理细胞后,发现p38 MAPK和p53抑制剂均可抑制p21、p16、Rb的蛋白表达,减轻细胞衰老,进一步发现p38 MAPK抑制剂可抑制p53蛋白表达,而p53抑制剂并不影响p38 MAPK的磷酸化。结论:TXNIP可以促进胰岛β细胞衰老,其机制与TXNIP上调p21、p16、Rb蛋白表达有关。TXNIP可以通过Trx依赖途径促进p38 MAPK磷酸化及后续的p16、p53表达上调,也可通过Trx非依赖途径增加p53蛋白表达,进而增加p21、Rb蛋白表达,从而引起INS-1细胞衰老。