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原花青素类化合物广泛的分布于植物界，由于其很强的抗氧化和清除自由基的能力及多种药理作用，使其在食品、医药、化妆品等领域得到了广泛的应用。恶性肿瘤是危害人类生命和健康的一种严重疾病，不少国家因恶性肿瘤死亡的人数占总死因首位；而口腔癌约占全部肿瘤的3％(瑞典)、5％(美国)、到40％(东南亚及印度)不等，口腔鳞状细胞癌约占口腔癌的80％以上。据报道原花青素类化合物对口腔癌、皮肤癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌等都有一定的预防或治疗作用。莲房原花青素(LSPC)由本研究室研究开发，并已发现有多种药理作用。本论文从细胞水平、亚细胞水平及整体动物水平研究LSPC对口腔癌的药理作用。通过细胞生长实验和形态学观察，首次证明了LSPC对人口腔表皮样癌(KB)细胞具有毒性作用，这种毒性作用的机制是LSPC可诱导KB细胞凋亡，影响KB细胞表面黏附分子CD44的表达；同时在整体动物水平上首次证明了LSPC对DMBA诱发金黄地鼠颊囊癌变具有化学预防作用。以此为拓宽莲房原花青素的应用及为口腔鳞癌的防治提供科学依据。 主要研究结果如下： 1．LSPC对KB细胞生长的影响 运用MTT法测定了LSPC对KB细胞增殖的抑制作用及对小鼠成纤维细胞L929的毒性，以选出LSPC对KB细胞最佳作用浓度作后续研究。当LSPC与KB细胞和L929细胞分别作用24h时，LSPC浓度在100～1000μg／mL时能显著的抑制KB细胞的生长且呈剂量效应关系，但在50μg／mL时显著的促进KB细胞的生长；同时，LSPC浓度在400～1000μg／mL时，显著的抑制了L929细胞的莲房原花青素对口腔癌的药理作用及其机制研究生长，但在100一300林g/mL时不影响其生长，而在50协岁mL时又显著的抑制了其生长，提示LSPC对癌细胞的毒作用和对正常细胞的保护作用有一个最佳的剂量范围。综合两者，可得LsPc对KB细胞最佳作用浓度为200一400协g/mL。2.LSPC对KB细胞形态的影响 采用相差显微镜、HE常规染色光学显微镜和透射电镜观察了LSPC对KB细胞作用引起的形态变化。用不同浓度的LSPC作用KB细胞后，相差显微镜下可见细胞变圆、变小，细胞膜透亮，细胞漂浮，表明细胞分裂减少，生长受到抑制。HE常规染色光镜下可见细胞核向细胞膜边集、突出，细胞皱缩、变圆、变小，出现碎核，表明LSPC对KB细胞有细胞毒作用，且细胞呈现凋亡现象。透射电镜下可见桥粒结构消失，细胞萎缩，胞内出现大量的空泡，染色质边集，断裂等，出现凋亡的典型特征。以上三者结果均表明，LSPC可显著的抑制KB细胞的生长、改变KB细胞形态，并诱导KB细胞凋亡。3.LSPC诱导KB细胞凋亡作用研究 运用流式细胞仪，采用PI染色法和FITC-annexinV/Pl法，观察不同浓度LSPC诱导KB细胞凋亡作用，并通过检测KB细胞表面蛋白CD95表达量探讨LSPC诱导KB细胞凋亡途径。PI染色法结果显示，LSPC浓度在200林创mL、30卯创mL、40卯岁mL时，分别有7.5%、8.3%、17.5%KB细胞处于凋亡后期或已经坏死或是两者的混合;FITC一annexinV/PI法结果显示，当LSPC浓度在20即g加L时，部分KB细胞处于凋亡早期，而LsPc浓度在300林g/mL、400拼g/mL时，部分KB细胞处于凋亡后期或已经坏死或两者皆有。表明LSPC可诱导KB细胞凋亡，同时也可引起KB细胞坏死，且呈剂量效应关系。但随着LSPC浓度的增加，CD95蛋白表达量呈下降趋势，即KB细胞可由Fas途径引起凋亡的细胞数减少，与LSPC可诱导KB细胞凋亡作用结果不一致。这可能是LSPC与细胞表面蛋白CD95结合，从而阻碍了CD95一PE抗体与其结合，影响了测定结果;也可能是LSPC影响了CD95的表达量，LSPC诱导KB细胞凋亡作用不是通过Fas途径。由此可见，LSPC能诱导KB细胞凋亡，但凋亡途径尚待进一步研究证明。杜晓芬华中农业大学硕士学位论文4.LSPC对KB细胞表面豁附分子CD44蛋白表达量的影响 采用流式细胞术观测了LSPC对KB细胞表面豁附分子CD44v和CD44S蛋白表达量的影响。当KB细胞分别与100卜g/mL、200卜g/mL、300卜g/mL、400“g/mLLSPC作用时，CD44v蛋白表达量由6.31%分别上升至1 2.6%、18.1%、27.9%、39.3%;而分别与300拼g/mL、400件留mL LSpC作用时，CD44s蛋白表达量由89.9%分别下降至68.4%、56.3%。提示LSPC可改变KB细胞表面勃附分子CD44v和CD44S蛋白的表达量，从而起到抑制肿瘤的浸润和转移作用。5.LSPC对DMBA诱发金黄地鼠颊囊癌变的防治作用研究 整体动物实验结果表明，当用10Omgfkg·bw·d LSPC灌胃或涂布金黄地鼠颊囊时，以肉眼观察颊囊粘膜的变化、体重变化、死亡率、实验结束后被处死动物的心、肝、脾、肺、肾等脏器重量，以及血清中MDA、GSH一Px、T一SOD值和口腔粘膜组织常规HE染色病理观察等为指标，观察LSPC对DMBA诱发的金黄地鼠颊囊癌变的防治作用，结果表明: 灌胃和涂布LSPC对DMBA诱发金黄地鼠颊囊癌变均具有预防性效果，且以涂布LSPC的预防效果较佳。并研究表明灌胃LSPC主要通过降低机体自由基水平，提高机体抗氧化能力而起到作用;涂布LSPC主要是直接隔离DMBA对地鼠颊囊勃膜的激癌作用，以及降低机体内的自由基水平和提高机体的抗氧化能力的共同作用的结