柳树AP3同源基因的克隆与表达分析

来源 :南京林业大学 | 被引量 : 5次 | 上传用户:tanzhiming1985
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AP3基因在植物的花发育过程中具有重要作用,作为“ABC”模型的B类基因,AP3或PI与AG的作用决定雄蕊的特征。根据已知的杨树AP3同源基因PTD的保守区序列设计引物,以垂柳、黄花柳、黄枝白柳、杞柳、绵毛柳及簸箕柳总DNA为模板,均扩增出了大小约2.1K左右的片段。根据簸箕柳DNA测序结果设计引物,利用RT-PCR技术及5’RACE、3’RACE技术,获得了簸箕柳中AP3同源基因的全长cDNA序列。该基因cDNA全长为826bp,编码241个氨基酸,预测分子量大小为28kDa。 根据基因组扩增片断测序结果以及簸箕柳SSMADS基因全长aDNA序列,预测出垂柳、黄花柳、黄枝白柳、杞柳、绵毛柳中AP3同源基因的全长cDNA。分析表明,本实验所克隆的柳属植物AP3同源基因,在核苷酸水平和氨基酸水平均有很高的相似性,分别为95%-98.7%和95.2%-99.6%,虽然它们在序列上各有差异,但全部具有AP3基因所特有的保守区域,说明该基因在柳属植物中具有较好的保守性。 通过实时定量RT-PCR分析,发现SSMADS基因主要在簸箕柳花器官中表达,在根、茎、叶中虽然有少量表达,但表达量很低。在花器官发育的不同阶段,SSMADS基因表达量也不同,在花发育的早期阶段,其表达量较低,随着花器官的发育,其表达量有所增加,然后随着花器官的成熟表达量又降低。 将水稻AP3同源基因OsMADS16的RNAi植物表达载体转入农杆菌,用叶盘法转化烟草,得到95株潮霉素抗性芽。当芽长到1.5cmc以上时,移入附加有hygromycin 50mg/L的MS培养基上,大部分植株在20天左右都能正常生根。对22株转基因抗性植株进行检测,18株为PCR阳性。转基因烟草在转化前后花器官的表型变化尚在观察之中。烟草转化的成功为进行簸箕柳的转化奠定了一定的技术基础。 以簸箕柳当年春季萌生的新枝条为外植体,建立了其植株再生体系。探讨了基本培养基和不同组合的激素对丛生芽诱导的影响,结果表明不同基本培养基对丛生芽的诱导无太大影响,而BA为1.0mg/L、NM为0.01mg/L时,丛生芽诱导率达到了最大,为100%;平均诱导芽数为3个/株;芽的生长状况也较好。当丛生芽长到3cm左右时,切下,在不加激素的White或B5两种基本培养基诱导其生根,生根率可达90%以上。簸箕柳组培再生体系的建立为进一步用转基因方法验证簸箕柳AP3同源基因的功能提供了技术平台。
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