论文部分内容阅读
双组分信号转导系统(Two-Component Signal Transduction System,TCS)是一类主要存在于细菌中的用于感知外界信号刺激并作出应答的系统。目前已经发现总共200-300种不同的TCS,而一个细菌中包含约20种TCS。TCS蛋白的结构和功能相对保守,对于细菌的生长、繁殖和耐药等生命活动至关重要,但同时却并不存在于人类及哺乳动物细胞中,因此TCS被认为是一种潜在的新型抗菌药物靶点。常规的一个TCS由一对蛋白质组成,分别为组氨酸激酶(Histine kinase,HK)和应答调节蛋白(Response Regulator,RR)。TCS系统通过磷酸传递发挥其生物学功能,即HK蛋白感知外界信号刺激后与ATP反应并完成自磷酸化,自磷酸化完成后的HK蛋白可以将下游RR蛋白磷酸化,被磷酸化的RR蛋白会与对应的基因相结合,并调控其表达。HK蛋白不仅可以使RR蛋白磷酸化,其同时具有将磷酸化的RR蛋白去磷酸化的功能,HK蛋白通过磷酸激酶和磷酸酶的双功能,精准调控磷酸化RR的量,以完成对信号刺激的准确应答。HK蛋白作为一种多功能的酶类,针对其功能的抑制剂研究相对于RR较多,但同时由于其复杂的生物学功能,难以获得的跨膜结构,目前对于其抑制剂的详细机制研究和HK蛋白本身磷酸传递功能的研究还远远不足。因此,本文以HK853蛋白的胞内全长(HK853cp)以及CA结构域(HK853CA)作为主要研究对象,以核磁共振波谱仪为主要分析仪器,建立了用31P谱研究HK853催化ATP、ADP以及AMP相互转化的分析方法。对于反应中产生的含磷物质ATP、ADP、AMP和自由磷进行了信号归属,通过不断采集31P谱观察HK853催化ATP和ADP相互转化的速度,并以此作为HK853多功能酶活性的分析指标。同时本文对HK853CA的15N-1H HSQC谱进行了主链以及部分侧链的归属,15N-1H HSQC谱作为蛋白质的“指纹图谱”,可以帮助我们详细分析酶促反应过程中蛋白质各个氨基酸残基的变化以及整体构象的变化。通过上述实验,本文验证了黄酮类小分子木犀草素对于HK853cp自磷酸化活性的抑制,并进一步通过ITC实验定量分析了HK853cp与木犀草素的结合比例及解离常数。通过ADP和木犀草素分别滴定HK853CA的15N-1H HSQC谱图,分析了抑制剂木犀草素和ADP与HK853CA的结合对其造成的不同影响,并进一步探究了其产生抑制作用的原因。采用分子模拟获得木犀草素与11HK853CA结合的具体空间位置、结合位点及作用力,并将分子模拟结果与15N-1H HSQC滴定结果作为对比,验证了结果的可信性。最终结果表明,木犀草素通过10个氢键作用力以及一个π-π共轭作用力与HK853的CA结构域相结合,并占用了ADP与蛋白质结合的空间位置,影响了蛋白质酶活关键性区域及部分位点,同时该结合对于蛋白质的构象造成了一定的影响。基于上述原因,木犀草素可以在一定程度上抑制HK853的自磷酸化活性。本文同时通过抑菌实验,验证了木犀草素具有一定的抑菌作用。本文还应用31P NMR和ITC实验相结合的方法,通过对HK853 ATP Lid的整体突变及Y437位点的单点突变,研究了该区域及该位点对于HK853自磷酸化活性的影响。结果表明,ATP Lid对于HK853的自磷酸化活性有一定的影响,其中437位点的带电性,可能是影响HK853自磷酸化活性的重要因素之一。最后,本文发现了HK蛋白的新的酶活功能,即将ADP转变为ATP和AMP的酶活性。我们采用31P NMR与15N-1H HSQC相结合的实验方法,对于该酶活功能的关键性区域及位点进行了搜寻,对该新功能的生物学意义进行了初步的研究,并且依据实验最终推测了HK853催化ADP生成ATP和AMP的酶促反应机制。结果表明,HK853的R430、N376和K383位点对于酶促反应速率有重要的作用;DHp domain和ATP Lid对于反应速率具有一定的调控作用;降低ATP与HK853亲和力的N380A突变可以一定程度上提高酶促反应速率;而可以接收磷酸基团的H260位点的突变对于反应速率没有显著的影响。同时我们发现HK853催化ADP生成ATP反应迅速,且在仅有ADP存在情况下可以最终完成HK853→RR468的磷酸基团传递,因此,我们推测该ATP合成活性可能在细菌面对极端条件下发挥作用。最终,本文推测HK蛋白催化的反应为2ADP→ATP+AMP,其中一分子ADP断裂高能磷酸键,释放能量和磷酸基团变为AMP,另一分子ADP接收磷酸基团并合成高能磷酸键而生成ATP。综上所述,本文对于HK853自磷酸化抑制剂木犀草素的抑制机制进行了细致的研究,并且对HK853的自磷酸化功能及新功能—ATP合成功能进行了初步研究。本文研究结果对于后续针对HK蛋白的抑制剂开发提供了一定的实验基础,也对今后针对HK蛋白本身的功能研究,尤其是HK蛋白的ATP合成功能研究提供了一个很好的开端和方向。