【摘 要】
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抗菌肽是广泛存在于自然界生物体中的多肽,是生物体先天免疫的重要组成部分。因其具有抗菌活性强、广谱抗菌、热稳定性及不易产生耐药性等优点而广受人们的关注。 绵羊骨
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抗菌肽是广泛存在于自然界生物体中的多肽,是生物体先天免疫的重要组成部分。因其具有抗菌活性强、广谱抗菌、热稳定性及不易产生耐药性等优点而广受人们的关注。
绵羊骨髓抗菌肽(SMAP-29)是1995年Bagella和Margherita Zanetti等研究小组在绵羊的骨髓mRNA中发现的,具有两亲性α-螺旋结构域,属于cathelicidins家族,含29个氨基酸残基,有很强的抗细菌、真菌、中和内毒素等生物学功能。
本研究以GenBank发表的SMAP-29基因(L46854)为模板,参照毕赤巴斯德酵母(Pichia pastotls)密码子偏好性,设计合成了抗菌肽SMAP-29成熟肽目的基因片段。通过基因重组的方法将合成的基因克隆入pPIC3.5K载体中构建重组酵母胞内表达载体pPIC3.5K-SMAP-29,经酶切分析、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。将构建成功的载体电击转化至毕赤酵母受体菌GS115中,经G418筛选高拷贝转化子,并用MM、MD板和PCR法筛选Mut+表型。对构建好的重组酵母表达基因工程菌用甲醇诱导表达,裂解酵母细胞进行Tricine-SDS-PAGE分析,结果在诱导至第2天的细胞裂解液中检测到与预测的SMAP-29分子量相当,约为3.2KD的表达带。Trizol法提取酵母总RNA,通过RT-PCR扩增SMAP-29 mRNA,发现表达期的酵母细胞中存在SMAP-29 mRNA,而对照没有检出,表明SMAP-29在毕赤酵母中存在表达。表达产物经凝胶过滤色谱处理后进行抑菌活性检测,结果表明该表达产物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC2592)和白色念珠菌(Candida albicans ATCC2002)有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌抑制效果不明显。
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