目的:失血性休克(hemorrhagic shock, HS)及液体复苏可引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),SIRS发展失控必然导致多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS);SIRS在肺部表现为急性肺损伤(acute lung injury, ALI)。SIRS→ALI→ARDS→MODS,体现着多米诺骨牌效应。因此,明确HS时ALI/ARDS的发病机制,早期预防和治疗ALI/ARDS,对降低HS的死亡率及改善疾病的预后具有重要意义。HS导致肠源性菌血症和内毒素血症,是诱发ALI/ARDS的重要因素。继发的中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils, PMNs)过度活化,肺内炎症反应失控,肺血管内皮细胞的坏死和凋亡等是构成HS液体复苏后ALI/ARDS的主要作用机制。在ALI/ARDS的发病进程中,炎症反应导致肺通透性增高,其在内源性ARDS主要表现在肺微血管内皮;外源性ARDS则主要开始于肺泡上皮。炎症介质的释放、中性粒细胞与内皮细胞的相互作用以及细胞骨架的变化是导致肺微血管内皮通透性增高的主要原因。HS后,尤其是在血源匮乏的情况下,复苏液体的选择要优先考虑在有效恢复血流动力学的前提下,改善机体的病理生理状况,提高生存率。羟乙基淀粉是临床上最常用的血浆容量扩张剂,其扩容强度和维持时间,决定于它们的浓度和相对分子质量以及克分子取代程度和取代方式。6%HES130/0.4(6%hydroxyethyl starch 130/0.4, Voluven)是最新一代羟乙基淀粉,克分子量为130 000道尔顿,取代级为0.4,C2/C6羟乙基化的比率为9︰1;与其他HES溶液和右旋糖苷比较,容量扩容效果相同,但副作用更少。6%HES130/0.4除具有良好的扩容作用外,还可减少白细胞迁移,减轻炎性反应,可减轻大鼠内毒素性ALI,但其对HS液体复苏后继发肺损伤的作用及其机制尚无定论,故本研究欲加以探讨。本课题选用实验外科技术,采用颈总动脉放血法造成大鼠失血性休克,应用有创动脉血压监测技术对不同休克维持时间的大鼠行液体复苏,建立SD大鼠HS液体复苏后继发ALI模型,并在此基础上用HES130/0.4早期干预;应用血气分析、病理形态学观察、透射电镜技术、流式细胞术、酶联免疫技术等检测方法,观察肺功能变化、肺脏病理形态及超微结构变化、肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-10含量的变化以及动脉血中性粒细胞CD11b、CD18表达的变化,探讨肺血管内皮细胞及中性粒细胞在HS液体复苏后继发ALI病程进展中的作用及机制,以及HES130/0.4对HS液体复苏后继发ALI早期干预的作用及机制;并在动物实验基础上,进一步观察了HES130/0.4对体外培养的肺微血管内皮细胞损伤的作用及相关机理,为HS液体复苏致ALI的早期干预提供新的治疗策略及理论依据。方法:第一部分:失血性休克大鼠液体复苏后继发肺损伤模型的建立48只SD大鼠,按随机数字表法分为45min休克组(H45组)及45min对照组(C45组)、60min休克组(H60组)及60min对照组(C60组)和90min休克组(H90组)及90min对照组(C90组),每组8只。对照组仅麻醉及行动静脉穿刺置管,不放血及液体复苏。不同休克时间组按休克维持时间分为H45组、H60组以及H90组。颈总动脉放血法造成大鼠失血性休克,按照实验设计分别维持不同休克时段后,通过左侧股静脉输注三倍最大放血量的林格氏液进行复苏。计算各组的失血程度;记录不同时间点MAP;分别于休克前、液体复苏前即刻以及复苏后2、3h时行血气分析,并计算PO2/FiO2的比值;复苏3h后采用颈总动脉放血法快速处死动物,大体观察各组肺脏充血、水肿、出血情况,光镜下观察肺组织病理学变化,并计算各组肺组织的病理评分,测定支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白浓度和肺湿/干重比(W/D)。第二部分:6%HES130/0.4对失血性休克大鼠液体复苏后肺组织TNF-α、IL-1β和IL-10的影响成年雄性SD大鼠24只,按随机数字表法随机分为对照组(control组)、林格氏液组(RS组)、33ml/kg复苏组(H1组)、50ml/kg-1复苏组(H2组),每组6只。对照组(control组)仅麻醉及进行动静脉穿刺,不放血;林格氏液组(RS组)用三倍最大放血量的林格氏液复苏;H1组、H2组分别用33ml/kg、50ml/kg的羟乙基淀粉和林格氏液复苏。为保证理论上复苏效果的相同,H1、H2组复苏所用林格氏液的量为3倍最大的放血量减去相应剂量的羟乙基淀粉。计算各休克组的最大失血程度;记录不同时间点MAP;分别于休克前(T0),休克后复苏前(T1),复苏后2(T4)、3(T5)h行血气分析,并计算PaO2/FiO2;于复苏后3h处死动物,测定BALF蛋白浓度及肺W/D;测定肺组织肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-10(IL-10)的含量;大体观察肺脏充血、水肿、出血情况;光镜下观察肺组织病理学变化并计算肺组织的病理评分;透射电镜下观察肺超微组织结构变化。第三部分:6%HES130/0.4对失血性休克大鼠液体复苏后肺组织MDA、SOD和MPO的影响动物选择与分组同第二部分。休克组分别于液体复后3h、control组于相应时间点处死动物,取右肺下叶肺组织测定MDA含量、SOD和MPO活性。第四部分:6%HES130/0.4对失血性休克大鼠液体复苏后血中性粒细胞CD11b和CD18表达的影响动物的选择和分组、HS模型的复制同第二部分;分别于休克前(T0),复苏前即刻(T1),复苏后2h(T4)、3h(T5)行血气分析;流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测动脉中性粒细胞CD11b和CD18的表达水平;复苏后大体观察肺脏充血、水肿、出血情况;光镜下观察肺组织病理学变化并计算肺组织的病理评分;透射电镜下观察肺超微组织结构变化。第五部分:6%HES130/0.4对大鼠肺微血管内皮细胞凋亡率的影响1用改良组织块法进行肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cell, PMVECs)原代培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态,扫描电镜、透射电镜下观察细胞形态及超微结构,进行细胞鉴定;2-3代培养的细胞用于下一步实验。2将所得的PMVECs悬液浓度调整到1×109个/ml, 24孔细胞培养板中每孔加入1ml细胞悬液,共15孔,随机分为3组,空白对照组(C组)、LPS处理组(L组)和HES干预组(H组),每组5孔。L组加入1μg/ml LPS和等体积PBS液,H组加入1μg/ml LPS、等体积PBS液以及6% HES130/0.430mg/ml;C组加入等体积PBS液。将细胞培养板置于CO2细胞培养箱中,分别孵育3h后取出培养板后收集细胞。透射电镜、扫描电镜下观察细胞形态及超微结构;流式细胞仪检测PMVECs凋亡率和细胞增殖情况结果:第一部分:失血性休克大鼠液体复苏后继发肺损伤模型的建立1各休克组大鼠失血程度、MAP组间差异无统计学意义;2与各对照组比较,各休克组于T1时间点PaO2/FiO2升高,PaCO2降低(P<0.05);H45组、H90组于T5时间点PaO2/FiO2降低(P<0.05)。与H45组比较, H60组、H90组于T4时间点PaO2/FiO2、PaCO2降低(P<0.05)。与H60组比较,H90组于T5时间点PaO2/FiO2降低,于T4、T5时间点PH升高(P<0.05);3.1肺大体观察结果:各对照组无明显改变;各休克组肺脏可见不同程度的缺血、充血和水肿,以H90组最为明显。3.2各对照组肺泡结构未见明显异常;H45组、H60组肺间质增宽,炎性细胞浸润,H60组小支气管见炎性渗出和浸润;H90组肺泡腔内见红细胞及炎性细胞,肺间质增宽,炎性细胞浸润,间质小血管扩张充血;与各自对照组比较,H45组、H60组和H90肺组织病理评分增高(P<0.05);与H45或者H60组比较,H90肺组织病理评分增高(P<0.05);3.3各对照组肺组织超微结构未见明显异常;H45组肺泡Ⅱ型细胞基本正常,板层颗粒正常,线粒体膜缺损;H60组核周间隙扩张,粗面内质网轻度扩张;H90组血管内皮基底膜断裂,气血屏障结构模糊,水肿增厚;3.4与对照组比较,各休克组BALF蛋白浓度、肺W/D不同程度升高(P<0.05或0.01);与H45或H60比较,H90组BALF蛋白浓度、肺W/D显著升高(P<0.05或0.01);第二部分6%HES130/0.4对失血性休克大鼠液体复苏后肺组织TNF-α、IL-1β和IL-10的影响1各液体复苏组最大失血程度、不同时间点MAP组间比较差异无统计学意义;2与control组比较,RS组、H1、H2组于T1时间点PaO2/FiO2升高,PaCO2降低(P<0.05);RS组于T4、T5时间点,H2组于T5时间点PaO2/FiO2(P<0.05)。与RS组比较, H1组T4、T5时间点,H2组于T4时间点PaO2/FiO2升高,H1、H2组于T4时间点PaCO2升高(P<0.05);与H1组比较,H2组于T5时间点PaO2/FiO2降低(P<0.05);3与control组比较,RS组、H1、H2组肺组织匀浆TNF-α、IL-1β和IL-10含量、BALF蛋白浓度、W/D升高(P<0.05);与RS组比较,H1、H2组肺组织匀浆TNF-α、IL-1β含量降低,IL-10含量升高,BALF蛋白浓度、肺W/D降低(P<0.05);4.1肺大体观察结果:control组无明显改变;各液体复苏组肺脏可见不同程度的缺血、充血和水肿,以RS组最为明显;4.2 control组肺泡结构正常;RS组肺泡腔内见红细胞及炎性细胞,肺间质增宽,炎性细胞浸润,间质小血管扩张充血;H1组和H2组肺间质增宽,炎性细胞浸润,小支气管见炎性渗出和浸润;H1组、H2组肺组织损伤较RS组轻,其中H1组损伤最轻。与control组比较,各液体复苏组肺组织病理评分增高(P<0.05);与RS组比较,H1组和H2组肺组织病理评分降低(P<0.05);与H1组比较,H2组肺组织病理评分增高(P<0.05);4.3 control组肺超微组织形态结构未见异常;RS组肺组织超微结构受损,血管内皮基底膜断裂,Ⅱ型上皮细胞微绒毛明显减少,粗面内质网扩张,可见颗粒融合现象;H1组除线粒体结构轻微改变外基本接近正常; H2组核周间隙轻度扩张,粗面内质网轻度扩张,有脱颗粒;第三部分:6%HES130/0.4对失血性休克大鼠液体复苏后肺组织MDA、SOD和MPO的影响1与control组比较,RS组、H1组和H2组MDA含量升高(P<0.05);与RS组比较,H1组和H2组MDA含量降低(P<0.05);与H1组比较,H2组MDA含量升高(P<0.05);2与control组比较,RS组、H1组和H2组SOD活性降低(P<0.05);与RS组比较,H1组和H2组SOD活性升高(P<0.05);与H1组比较,H2组SOD活性减低(P<0.05);3与control组比较,RS组、H1组和H2组MPO活性升高(P<0.05);与RS组比较,H1组和H2组MPO活性降低(P<0.05);第四部分:6%HES130/0.4对失血性休克大鼠液体复苏后血中性粒细胞CD11b和CD18表达的影响1复苏后各时点MAP组间比较差异无统计学意义。2与control组比较,各液体复苏组于T1时间点PaO2升高,T1~5 PaCO2均降低(P<0.05);与T0比较,各液体复苏组PaO2于T1时间点、H1组T1~5时间点、H2组T5时间点升高;PaCO2各液体复苏组T1~5时间点降低;除H1组外,各液体复苏组PH于T4、5时间点降低(P<0.05);3与control组比较,各液体复苏组于T1、T4、T5时间点CD11b和CD18的表达增强(P<0.05);与RS组比较,H1、H2组于T4、T5时间点CD11b和CD18的表达降低(P<0.05);与H1组比较,H2组于T4、T5时间点CD11b和CD18的表达增强(P<0.05);4.1肺大体观察结果:control组无明显改变;各液体复苏组肺脏可见不同程度的缺血、充血和水肿,以RS组最为明显;4.2 control组肺泡结构正常;RS组肺泡腔内见红细胞及炎性细胞,肺间质增宽,炎性细胞浸润,间质小血管扩张充血;H1组和H2组肺间质增宽,炎性细胞浸润,小支气管见炎性渗出和浸润;H1组、H2组肺组织损伤较RS组轻,其中H1组损伤最轻。与control组比较,各液体复苏组肺组织病理评分增高(P<0.05);与RS组比较,H1组和H2组肺组织病理评分降低(P<0.05);与H1组比较,H2组肺组织病理评分增高(P<0.05);4.3 control组肺超微组织形态结构未见异常;RS组肺组织超微结构受损,血管内皮基底膜断裂,Ⅱ型上皮细胞微绒毛明显减少,粗面内质网扩张,可见颗粒融合现象;H1组除线粒体结构轻微改变外基本接近正常; H2组核周间隙轻度扩张,粗面内质网轻度扩张,有脱颗粒;第五部分:6%HES130/0.4对大鼠肺微血管内皮细胞凋亡率的影响1倒置显微镜下观察,培养的细胞呈铺路石样排列;扫描电子显微镜观察到培养的细胞表面存在微绒毛,细胞表面存在窗孔;透射电镜下内皮细胞表面有胞浆突起,核仁大且明显;胞质内有高尔基复合体,粗面内质网和滑面内质网发达;2扫描电镜结果:C组细胞细胞形态无明显变化,呈梭形或多角形;L组、H组部分细胞形态变圆,细胞边缘突起减少,未见凋亡小体;3 HES130/0.4对LPS诱导活化的PMVECs细胞增殖指数及凋亡率的影响:与C组比较,L组、H组PI无统计学差异(P>0.05);与L组比较,H组PI无统计学差异(P>0.05)。与C组比较,L组、H组凋亡率增加(P<0.05);与L组比较,H组凋亡率降低(P<0.05)。结论第一部分:失血性休克大鼠液体复苏后继发肺损伤模型的建立失血性休克大鼠在休克时间维持在90min后林格氏液复苏后3h肺功能、肺形态学出现典型的损伤性的变化,是稳定、可靠的失血性休克液体复苏后继发肺损伤的动物模型;第二部分:6%HES130/0.4对失血性休克大鼠液体复苏后肺组织TNF-α、IL-1β和IL-10的影响1与林格氏液比较,6%HES130/0.4可明显降低HS液体复苏后肺脏组织炎性介质TNF-α、IL-1和IL-10的含量,减轻失血性休克液体复苏后继发肺组织病理学损伤,从而改善肺的呼吸功能;2 6%HES130/0.4 33ml/kg和50ml/kg HES液体复苏能不同程度减轻肺脏炎性反应,且33ml/kg剂量复合林格氏液作用明显;第三部分:6%HES130/0.4对失血性休克大鼠液体复苏后肺组织MDA、SOD和MPO的影响与林格氏液复苏比较,6%HES130/0.4可减轻HS液体复苏后肺组织MDA、SOD和MPO的变化,进而减轻继发肺组织损伤,且33ml/kg 6% HES130/0.4复苏较50ml/kg剂量作用明显;第四部分:6%HES130/0.4对失血性休克大鼠液体复苏后血中性粒细胞CD11b和CD18表达的影响与林格氏液相比,6%HES130/0.4可使血中性粒细胞CD11b和CD18的表达显著降低,减轻肺组织的病理性损伤,从而改善肺功能;第五部分:6%HES130/0.4对大鼠肺微血管内皮细胞凋亡率的影响1 HES130/0.4处理后通过降低活化PMVECs凋亡率影响细胞的凋亡;2 HES130/0.4处理后所引起的细胞凋亡改变与细胞增殖周期的变化无明显关系。