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研究背景：
血管内皮细胞损伤是多种心血管疾病发生的共同病理改变，包括：高血压，血栓形成，动脉粥样硬化等。出核转运蛋白Exportin1(XPO1)锚定于细胞核膜，是负责核转运蛋白的一种运输载体，参与众多促进细胞存活或凋亡相关的蛋白的转运调节。出核转运蛋白XPO1的作用依赖于与RanGTPs形成的出核复合物，Ran连接蛋白3(RanBP3)是已知的XPO1发挥转运作用的重要辅助成分。因而，XPO1-RanBP3复合物即为XPO1发挥活性的重要部分。本团队前期研究证实XPO1可通过改变泛素链接酶E3RNF146的亚细胞定位，从而发挥对血管内皮细胞的保护作用。然而，XOP1自身是否直接参与血管紧张素II(Ang II)诱导的血管内皮损伤过程中，及其发挥作用的机制如何仍不明确。泛素蛋白酶体系统(UPS)主要负责细胞内损伤蛋白质的降解，维持细胞稳态。泛素连接酶E3神经前体细胞表达发育下调的蛋白4(Neural Precursor Cell Expressed Developmentally Down-Regulated Protein4，NEDD4)可与不同蛋白结合，促进底物泛素化修饰，NEDD4高表达是蛋白酶体降解信号。NEED4修饰后蛋白底物的结局，因底物修饰结构域或修饰氨基酸方式不同而异。目前，NEDD4在心血管内皮损伤中作用的详细机制尚未明确。
研究目的：
本研究探索泛素连接酶E3NEDD4是否通过参与调控XPO1介导底物蛋白出核转运水平，从而抑制AngII诱导的血管内皮细胞损伤。本研究结果将揭示NEDD4通过调控XPO1-RanBP3轴对细胞存活相关蛋白转运水平，明确对抗血管内皮损伤的潜在靶标，为指导临床疾病治疗提供理论依据。
研究方法：
本实验以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以及人肾小管近端上皮细胞(HK-2)为研究对象。血管紧张素II(Ang II)诱导用于构建模拟内皮细胞损伤模型。流式细胞术检测凋亡水平以及细胞内活性氧(ROS)生成，同时，以广泛研究结果认定通用的细胞凋亡相关蛋白(剪切后的Caspase3和凋亡相关因子AIF)的表达增高作为指标，以综合评估内皮细胞损伤程度。构建人全长NEDD4质粒，转染质粒增加NEDD4蛋白表达水平；构建Flag-XPO1,Myc-AIP4,Myc-SMURF1,Myc-NEDD4,Myc-WWP1质粒，以Flag及Myc为报告基因，检测对应蛋白之间的直接作用可能；构建RanBP3基因干扰片段，降低中血管内皮细胞RanBP3蛋白水平；分离细胞核浆蛋白，检测同一蛋白在不同亚细胞定位表达差异；结合实时荧光定量PCR(qPCR)，免疫印迹(Western Blot, WB)以及免疫共沉淀法(Co-IP)探寻分子机制。
研究结果：
1、NEDD4是哺乳动物中唯一与酵母Rsp5同源，该基因对应编码的蛋白质NEDD4是能与XPO1直接作用的E3连接酶。Co-IP的结果显示在HUVECs与HK-2细胞，与酵母同源性的HECT四个E3连接酶中，仅有NEDD4可直接与出核转运蛋白XPO1作用；
2、AngII诱导处理HUVECs后，流式检测显示：内皮细胞凋亡水平增高，细胞内ROS产生增多，与此同时，qPCR以及WB检测发现，NEDD4的蛋白表达水平下降；而转染p-NEDD4质粒，过表达NEDD4后，AngII导致的血管内皮损伤有所改善，表现为流式检测凋亡水平下降，与凋亡相关蛋白：剪切后的Caspase3(C-caspase3)及凋亡诱导因子(AIF)下降，同时细胞内ROS水平亦表现下降趋势；
3、NEDD4对血管内皮细胞的保护作用依赖于出核转运蛋白XPO1。一方面，NEDD4过表达可显著改变依赖XPO1核转运的蛋白RNF146以及TP53的细胞定位：细胞核中RNF146和TP53表达降低，而细胞浆内两者均表达增高。另一方面，XPO1抑制剂KPT-185可抵消NEDD4蛋白过表达后对损伤的血管内皮细胞发挥的保护作用：表现为KPT-185使用后，HUVECs中细胞内ROS水平增高，凋亡细胞数增高，凋亡相关蛋白C-caspase3以及AIF表达增高。
4、WB检测发现NEDD4过表达并不直接影响XPO1的蛋白水平表达。蛋白合成酶抑制剂放线菌酮(Cycloheximide，CHX)的使用显示，NEDD4不影响XPO1蛋白的合成；Co-IP结果显示：过表达NEDD4不改变K48-Ub泛素化修饰的XPO1水平，说明NEDD4不影响XPO1的泛素化降解，却可增加XPO1的K63-Ub泛素化修饰水平，维持XPO1的稳定，同时可以促进XPO1与核内脚手架结构蛋白RanBP3的结合。
5、构建RanBP3基因干扰片段，在HUVECs细胞转染该干扰片段，可明显有效降低RanBP3的表达，流式细胞检测结果表明，在RanBP3表达下降后，NEDD4对AngII诱导后的HUVECs保护作用被抵消，凋亡细胞数增加，细胞内ROS生成增多；凋亡相关蛋白C-caspase3以及AIF表达增高；RNF146与TP53由细胞核内向细胞浆转运受阻，两者在细胞核内堆积。进一步证实，NEDD4依赖于出核转运蛋白XPO1的调节作用中，RanBP3是必不可少的重要介导环节。
研究结论：
1、NEDD4可对抗Ang-II诱导的血管内皮细胞损伤；
2、NEDD4通过影响出核转运蛋白XPO1的功能发挥保护作用；
3、NEDD4增加K63-Ub泛素化修饰的XPO1，是促进XPO1-RanBP3相互作用的调节因素之一；
4、RanBP3是NEDD4发挥对血管内皮细胞保护作用的必要因素。
血管内皮细胞损伤是多种心血管疾病发生的共同病理改变，包括：高血压，血栓形成，动脉粥样硬化等。出核转运蛋白Exportin1(XPO1)锚定于细胞核膜，是负责核转运蛋白的一种运输载体，参与众多促进细胞存活或凋亡相关的蛋白的转运调节。出核转运蛋白XPO1的作用依赖于与RanGTPs形成的出核复合物，Ran连接蛋白3(RanBP3)是已知的XPO1发挥转运作用的重要辅助成分。因而，XPO1-RanBP3复合物即为XPO1发挥活性的重要部分。本团队前期研究证实XPO1可通过改变泛素链接酶E3RNF146的亚细胞定位，从而发挥对血管内皮细胞的保护作用。然而，XOP1自身是否直接参与血管紧张素II(Ang II)诱导的血管内皮损伤过程中，及其发挥作用的机制如何仍不明确。泛素蛋白酶体系统(UPS)主要负责细胞内损伤蛋白质的降解，维持细胞稳态。泛素连接酶E3神经前体细胞表达发育下调的蛋白4(Neural Precursor Cell Expressed Developmentally Down-Regulated Protein4，NEDD4)可与不同蛋白结合，促进底物泛素化修饰，NEDD4高表达是蛋白酶体降解信号。NEED4修饰后蛋白底物的结局，因底物修饰结构域或修饰氨基酸方式不同而异。目前，NEDD4在心血管内皮损伤中作用的详细机制尚未明确。
研究目的：
本研究探索泛素连接酶E3NEDD4是否通过参与调控XPO1介导底物蛋白出核转运水平，从而抑制AngII诱导的血管内皮细胞损伤。本研究结果将揭示NEDD4通过调控XPO1-RanBP3轴对细胞存活相关蛋白转运水平，明确对抗血管内皮损伤的潜在靶标，为指导临床疾病治疗提供理论依据。
研究方法：
本实验以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以及人肾小管近端上皮细胞(HK-2)为研究对象。血管紧张素II(Ang II)诱导用于构建模拟内皮细胞损伤模型。流式细胞术检测凋亡水平以及细胞内活性氧(ROS)生成，同时，以广泛研究结果认定通用的细胞凋亡相关蛋白(剪切后的Caspase3和凋亡相关因子AIF)的表达增高作为指标，以综合评估内皮细胞损伤程度。构建人全长NEDD4质粒，转染质粒增加NEDD4蛋白表达水平；构建Flag-XPO1,Myc-AIP4,Myc-SMURF1,Myc-NEDD4,Myc-WWP1质粒，以Flag及Myc为报告基因，检测对应蛋白之间的直接作用可能；构建RanBP3基因干扰片段，降低中血管内皮细胞RanBP3蛋白水平；分离细胞核浆蛋白，检测同一蛋白在不同亚细胞定位表达差异；结合实时荧光定量PCR(qPCR)，免疫印迹(Western Blot, WB)以及免疫共沉淀法(Co-IP)探寻分子机制。
研究结果：
1、NEDD4是哺乳动物中唯一与酵母Rsp5同源，该基因对应编码的蛋白质NEDD4是能与XPO1直接作用的E3连接酶。Co-IP的结果显示在HUVECs与HK-2细胞，与酵母同源性的HECT四个E3连接酶中，仅有NEDD4可直接与出核转运蛋白XPO1作用；
2、AngII诱导处理HUVECs后，流式检测显示：内皮细胞凋亡水平增高，细胞内ROS产生增多，与此同时，qPCR以及WB检测发现，NEDD4的蛋白表达水平下降；而转染p-NEDD4质粒，过表达NEDD4后，AngII导致的血管内皮损伤有所改善，表现为流式检测凋亡水平下降，与凋亡相关蛋白：剪切后的Caspase3(C-caspase3)及凋亡诱导因子(AIF)下降，同时细胞内ROS水平亦表现下降趋势；
3、NEDD4对血管内皮细胞的保护作用依赖于出核转运蛋白XPO1。一方面，NEDD4过表达可显著改变依赖XPO1核转运的蛋白RNF146以及TP53的细胞定位：细胞核中RNF146和TP53表达降低，而细胞浆内两者均表达增高。另一方面，XPO1抑制剂KPT-185可抵消NEDD4蛋白过表达后对损伤的血管内皮细胞发挥的保护作用：表现为KPT-185使用后，HUVECs中细胞内ROS水平增高，凋亡细胞数增高，凋亡相关蛋白C-caspase3以及AIF表达增高。
4、WB检测发现NEDD4过表达并不直接影响XPO1的蛋白水平表达。蛋白合成酶抑制剂放线菌酮(Cycloheximide，CHX)的使用显示，NEDD4不影响XPO1蛋白的合成；Co-IP结果显示：过表达NEDD4不改变K48-Ub泛素化修饰的XPO1水平，说明NEDD4不影响XPO1的泛素化降解，却可增加XPO1的K63-Ub泛素化修饰水平，维持XPO1的稳定，同时可以促进XPO1与核内脚手架结构蛋白RanBP3的结合。
5、构建RanBP3基因干扰片段，在HUVECs细胞转染该干扰片段，可明显有效降低RanBP3的表达，流式细胞检测结果表明，在RanBP3表达下降后，NEDD4对AngII诱导后的HUVECs保护作用被抵消，凋亡细胞数增加，细胞内ROS生成增多；凋亡相关蛋白C-caspase3以及AIF表达增高；RNF146与TP53由细胞核内向细胞浆转运受阻，两者在细胞核内堆积。进一步证实，NEDD4依赖于出核转运蛋白XPO1的调节作用中，RanBP3是必不可少的重要介导环节。
研究结论：
1、NEDD4可对抗Ang-II诱导的血管内皮细胞损伤；
2、NEDD4通过影响出核转运蛋白XPO1的功能发挥保护作用；
3、NEDD4增加K63-Ub泛素化修饰的XPO1，是促进XPO1-RanBP3相互作用的调节因素之一；
4、RanBP3是NEDD4发挥对血管内皮细胞保护作用的必要因素。