恶性肿瘤是我国主要的公共健康问题,其中喉癌(laryngeal carcinoma,LC)是我国最常见的头颈部恶性肿瘤,而喉癌以其日益增高的发病率,也逐渐引起广泛关注。喉癌的治疗包括手术治疗,放疗和化疗。然而,复发和转移比较常见,且预后仍不理想。因此需要迫切寻求一种新的方法治疗喉癌患者。黑色素瘤相关抗原(Melanoma antigen,MAGE)-A属于癌睾丸抗原(Cancer/testis antigens,CTA),高表达于多种肿瘤组织,而在除干细胞外的正常人体组织中均不表达。本课题组一直致力于MAGE-A家族在肿瘤中表达及意义的研究。而MAGE-A家族在喉鳞状细胞癌病人的表达模式仍不明。本研究利用免疫组织化学法分别检测MAGE-As(包括MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12)、MAGE-A9和MAGE-A11在喉鳞状细胞癌组织、相应正常黏膜组织中的表达及与其临床生物学指标和预后之间的关系。我们进一步通过甲基化特异性PCR(Methylation specific polymerase chain reaction,MSP)的方法检测了106例LSCC组织及22例相应的癌旁正常组织中MAGE-A1和MAGE-A3的甲基化水平,采用免疫组化法对这些组织中DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达情况进行了研究。并通过多重巢式RT-PCR(Multiple nested RT-PCR)检测MAGE-A基因在喉鳞状细胞癌外周血中的mRNA水平,从而为MAGE-A家族成为喉鳞状细胞癌预后监测的特异性指标提供理论依据。主要研究内容和结果如下:第一部分MAGE-A家族在喉鳞状细胞癌组织中的表达情况及临床意义目的:探讨黑色素瘤相关抗原MAGE-As、-A9和-A11在喉鳞状细胞癌组织,相应正常组织中的表达及与其临床生物学指标之间的关系,特别是预后意义。方法:1应用免疫组织化学法在睾丸组织中验证mage-as(包括mage-a1、-a2、-a3、-a4、-a6、-a10和-a12)、-a9和-a11的特异性。2应用免疫组织化学法检测106例lscc组织中mage-as、-a9和-a11蛋白的表达,分别用卡方检验,kaplan-meier生存分析以及cox回归分析检测蛋白表达与患者临床生物学指标及其预后的关系。结果:1mage-as(包括mage-a1、-a2、-a3、-a4、-a6、-a10和-a12)蛋白正常睾丸组织和lscc中均有表达。在正常睾丸组织中尤其精原细胞和精母细胞核中均显著表达。mage-as(包括mage-a1、-a2、-a3、-a4、-a6、-a10和-a12)蛋白在癌组织中主要定位于细胞质,部分定位于细胞核。106例正常黏膜组织中未发现mage-as(包括mage-a1、-a2、-a3、-a4、-a6、-a10和-a12)蛋白表达,lscc组织中mage-as(包括mage-a1、-a2、-a3、-a4、-a6、-a10和-a12)的阳性率为54.72%(58/106)。在lscc组织中,mage-as(包括mage-a1、-a2、-a3、-a4、-a6、-a10和-a12)蛋白表达与lscc患者的年龄、性别、吸烟量、临床分型、组织学分级均无相关性(p>0.05)但与临床分期、肿瘤大小和淋巴转移(p<0.05)呈正相关。2mage-a9蛋白正常睾丸组织和lscc组织中均有表达。在正常睾丸组织中尤其精原细胞和精母细胞核中均显著表达。mage-a9蛋白在癌组织中主要定位于细胞质,部分定位于细胞核。106例正常粘膜组织中未发现mage-a9蛋白表达,lscc组织中mage-a9的阳性率为46.22%(49/106)。在lscc组织中,mage-a9蛋白表达与lscc患者的年龄、性别、吸烟量、临床分型、组织学分级均无相关性(p>0.05)但与临床分期、肿瘤大小和淋巴转移(p<0.05)呈正相关。3mage-a11蛋白正常睾丸组织和lscc组织中均有表达。在正常睾丸组织中尤其精原细胞和精母细胞核中均显著表达。mage-a11蛋白在癌组织中主要定位于细胞质,部分定位于细胞核。106例正常黏膜组织中未发现mage-a11蛋白表达,lscc组织中mage-a11的阳性率为51.89%(55/106)。在lscc组织中,mage-a11蛋白表达与临床分期和肿瘤大小(p<0.05)呈正相关,mage-a11蛋白与lscc患者的年龄、组织学分级、淋巴转移均无相关性(p>0.05)。4106例lscc组织标本中,mage-as(包括mage-a1、-a2、-a3、-a4、-a6、-a10和-a12)、-a9和-a11蛋白表达呈均匀分布,三种蛋白同时表达的有35例,占33.02%(35/106)。106例lscc中三种蛋白阳性表达率之间无明显差异(χ2=1.585,p=0.453)。5lscc患者表达mage-as(包括mage-a1、-a2、-a3、-a4、-a6、-a10和-a12),mage-a9,mage-a11阳性的患者的总生存期比其表达阴性的患者低。多因素分析106例lscc患者的生存率,统计结果显示,年龄,性别,织学分级,肿瘤分型,吸烟与生存率均无明显相关性(p>0.05),而mage-as(包括mage-a1、-a2、-a3、-a4、-a6、-a10和-a12)蛋白高表达,mage-a9蛋白高表达,mage-a11蛋白高表达,临床分期,淋巴结转移,肿瘤大小与生存率相关(p<0.05)。cox回归模型分析表明mage-a9蛋白表达是lscc患者预后差的独立因素。结论:mage-as,-a9,-a11是lscc的肿瘤相关性抗原,可成为lscc免疫治疗的理想抗原。此外,mage-a9可作为lscc患者预后不良的指标。第二部分mage-a家族在喉鳞状细胞癌中表达的表观遗传学机制目的:探讨lscc及相应癌旁正常组织中mage-a1和mage-a3的甲基化水平,并分析其甲基化与对应标本中mage-a家族表达水平的关系。同时探讨了甲基转移酶dnmt1、dnmt3a和dnmt3b在lscc组织中的表达,并分析了其表达与标本中mage-a1和mage-a3甲基化状态及其与mage-a家族表达的相关性。方法:通过msp方法检测了106例lscc组织及22例相应的癌旁正常组织中mage-a1和mage-a3的甲基化水平,采用免疫组化法对这些组织中dna甲基转移酶dnmt1、dnmt3a和dnmt3b的表达情况进行了研究,mage-a1和mage-a3的甲基化采用χ2检验或fisher’s检验进行统计。dnmt1、dnmt3a和dnmt3b的表达与mage-a甲基化状态及mage-a表达之间的关系采用χ2检验或fisher’s检验进行统计,相关性采用spearman相关性检验。结果:1mage-a1基因在lscc组织中的非甲基化率为39.6%(42/106)。22例癌旁正常组织中mage-a1基因均为甲基化状态。2mage-a3基因在lscc组织中的非甲基化率为46.2%(49/106)。22例癌旁正常组织中mage-a3基因均为甲基化状态。3mage-a1和mage-a3基因启动子区去甲基化状态与整个mage-a家族的蛋白表达水平有显著正相关(r=0.388,p=0.000)(r=0.387,p=0.000)。4在lscc组织中,dnmt1、dnmt3a和dnmt3b蛋白的阳性染色主要定位于细胞核。106例lscc组织中有37例dnmt1蛋白表达阳性,阳性率为34.91%;40例dnmt3a蛋白表达阳性,阳性率为37.74%;35例dnmt3b蛋白表达阳性,阳性率为33.02%。lscc组织中mage-a1的去甲基化水平与甲基转移酶dnmt1、dnmt3a和dnmt3b的表达呈负相关关系(χ2=13.017,r=-0.350,p=0.000)(χ2=19.755,r=-0.432,p=0.000)(χ2=11.038,r=-0.323,p=0.001)。mage-a3的去甲基化水平与甲基转移酶dnmt1、dnmt3a和dnmt3b的表达也呈负相关关系(χ2=22.490,r=-0.480,p=0.000)(χ2=21.327,r=-0.449,p=0.000)(χ2=14.459,r=-0.369,p=0.000)。lscc组织中mage-as的表达与dna甲基转移酶dnmt1、dnmt3a和dnmt3b的表达均呈负相关关系(χ2=25.127,r=-0.487,p=0.000)(χ2=19.206,r=-0.426,p=0.000)(χ2=21.406,r=-0.449,p=0.000)。5eca109细胞中mage-as表达阳性,hep-2中mage-as表达阴性。6rt-pcr结果显示,未经药物处理的hep-2细胞未见mage-asmrna的表达。应用2.5μmol/l、5μmol/l5-aza-cdr分别作用细胞72小时后可见mage-as基因重新表达,随着药物浓度增高,mage-as基因表达增强。结论:dna甲基转移酶dnmt家族通过参与mage-a家族的甲基化过程调控mage-a基因的表达,在lscc的发生发展过程中可能发挥重要作用。第三部分喉鳞状细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞中mage-a基因的表达目的:探讨mage-a基因在lscc外周血循环肿瘤细胞中的表达及与预后的相关性。方法:采用多重巢式rt-pcr(multiplexnestedrt-pcr)方法检测65例lscc患者和30例健康人外周血中mage-a基因的mrna表达水平,并利用酶切的方法鉴定该家族成员mage-a1、-a2、-a3、-a4和-a6的表达情况。同时利用普通rt-pcr方法检测mage-a9和mage-a11基因的表达情况。结果:1mage-a基因在lscc患者外周血中表达率为29.23%(19/65)。应用每一种基因所对应的限制性内切酶bcli、ecori、eco47iii、sphi和afliii进行酶切实验,观察到mage-a基因在lscc外周血中的表达顺序为a2>a3>a1>a4>a6。mage-a1的表达率为16.90%(11/65),mage-a2的表达率21.54%(14/65),mage-a3的表达率为20%(13/65),mage-a4的表达率为15.38%(10/65),mage-a6的表达率为13.85%(9/65),mage-a9的表达率为18.46%(12/65),mage-a11的表达率为23.08%(15/65)。17(17/65)个lscc患者外周血只表达一种mage-a基因,11(11/65)个lscc患者外周血表达两种mage-a基因,8(8/65)个lscc患者外周血表达三种mage-a基因,0(0/65)个lscc患者外周血同时表达四种mage-a基因,5(5/65)个lscc患者外周血同时表达五种mage-a基因,3(3/65)个lscc患者外周血表达六种mage-a基因,其中2(2/65)个lscc患者外周血中同时表达七种mage-a基因。2mage-a基因的表达与多个临床指标存在相关性。mage-a2基因的表达率随LSCC患者肿瘤大小的增加而增加(χ2=4.916,P=0.027)。MAGE-A9基因的表达率随LSCC患者肿瘤大小的增加而增加(χ2=7.304,P=0.007)。MAGE-A6基因的表达率随LSCC患者组织学分级的增加而增加(χ2=4.746,P=0.029)。存在淋巴结转移的LSCC患者MAGE-A基因的表达率显著高于非淋巴结转移的患者(χ2=17.868,P=0.000)。存在淋巴结转移的LSCC患者MAGE-A1基因的表达率显著高于非淋巴结转移的患者(χ2=10.943,P=0.001)。存在淋巴结转移的LSCC患者MAGE-A2基因的表达率显著高于非淋巴结转移的患者(χ2=13.848,P=0.000)。存在淋巴结转移的LSCC患者MAGE-A3基因的表达率显著高于非淋巴结转移的患者(χ2=16.250,P=0.000)。存在淋巴结转移的LSCC患者MAGE-A4基因的表达率显著高于非淋巴结转移的患者(χ2=13.446,P=0.000)。存在淋巴结转移的LSCC患者MAGE-A6基因的表达率显著高于非淋巴结转移的患者(χ2=16.565,P=0.000)。存在淋巴结转移的LSCC患者MAGE-A9基因的表达率显著高于非淋巴结转移的患者(χ2=18.092,P=0.000)。存在淋巴结转移的LSCC患者MAGE-A11基因的表达率显著高于非淋巴结转移的患者(χ2=21.262,P=0.000)。MAGE-A基因的表达率随LSCC患者临床分期的递增而增加(χ2=5.311,P=0.021),MAGE-A1基因的表达率随LSCC患者临床分期的递增而增加(χ2=6.237,P=0.013),MAGE-A2基因的表达率随LSCC患者临床分期的递增而增加(χ2=6.032,P=0.014),MAGE-A11基因的表达率随LSCC患者临床分期的递增而增加(χ2=10.543,P=0.001)。MAGE-A基因的表达率随LSCC患者吸烟量增加而增加(χ2=5.831,P=0.016)。MAGE-A2基因的表达率随LSCC患者吸烟量增加而增加(χ2=4.406,P=0.036)。MAGE-A3基因的表达率随LSCC患者吸烟量增加而增加(χ2=4.406,P=0.036)。结论:1 MAGE-A基因在外周血的表达有可能作为检测LSCC患者外周血循环肿瘤细胞的标记。2外周血中MAGE-A基因的表达可能与LSCC的不良预后相关,可作为监测LSCC预后的重要指标。