研究背景Menkes病(Menkes disease, MD)又称卷发综合征,是一种罕见的先天性铜代谢异常的疾病。1962年由Menkes等首先描述。是由于正常编码铜转运ATP酶的ATP7A基因缺陷导致的罕见的先天性铜缺乏性疾病。该病是一种进行性、系统性的疾病,尤以中枢神经系统和结缔组织损害最为严重,多3岁前死亡。国外报道Menkes病的发病率约为1/50,000-1/250,000活产婴,日本学者在1993年到2003年对Menkes病的发病率研究显示其发病率为1/2,800,000活产婴儿,男婴的发病率为4.9/1,000,000,国内尚无发病率的报道,仅有极少数的个例或家系报道。其典型的临床特点：精神运动发育倒退、喂养困难、生长发育迟缓和癫痫发作。毛发扭结在一起,无光泽、易断,特别是在头皮遭受摩擦时。骨骼异常包括：漏斗胸、鸡胸及自发性骨折。松驰且干燥的皮肤很早就可能被观察到。常规眼底检查通常是正常的,但在后期,患儿通常不能正常进行视觉跟踪。Menkes病晚期则表现为失盲、硬膜下血肿、呼吸衰竭。大多数患儿在3岁之前,因感染、血管并发症(如由于脑血管破裂导致的突然大量出血)、自身的精神发育退化而死亡。神经系统查体则可见重度躯干肌张力减低,伴有头控差。脑电图常呈中至重度异常,见多灶性棘慢波,有时为高峰失律表现。MRA检查则多见颅内血管增多增粗,走行迂曲。X线可见骨骼干骺端有骨刺,骨骼发育不良及先天性颅骨骨折等。双眼可有角膜发育不良,视乳头苍白及网膜色素减低等,不存在KF环。实验室检查：血清铜减低,血浆铜蓝蛋白减低。目前研究认为ATP7A基因突变是Menkes病的主要致病原因,ATP7A基因广泛分布在脑、肾、肺等器官,但肝脏中却无分布。ATP7A基因位于Xq13.3,大小约141kb,包含23个外显子,编码一种1500个氨基酸的跨膜铜离子转运蛋白(P型铜转运ATP酶),称为MNK蛋白,其结构：氨基端含有6个铜结合位点,羧基端为铜转运功能结构域,分别为ATP结合结构域、磷酸化结构域和激活结构城。MNK蛋白是铜离子进行跨膜转运的离子泵,通过8个跨膜区域形成的孔道使铜离子泵出细胞。铜离子是人体新陈代谢所必需的微量元素,它是许多酶的辅因子,同时也参与众多生化反应。在Menkes病中,ATP7A基因突变导致MNK蛋白结构及功能的改变,使患者的肠黏膜对食物中的铜吸收障碍,同时不能使细胞中铜转运至细胞间液或血浆中,导致血浆和脑组织中铜离子浓度下降,从而继发各种铜依赖酶功能障碍而出现临床症状。Menkes病为一种严重的遗传性疾病,预后极其不良,目前治疗手段仍处于试验阶段,仅对部分早期轻症患者有效。故早期诊断显得尤为重要。目前诊断主要依赖于实验室检查的特征性结果,血清铜<11μmol/L,铜蓝蛋白<200mg/L。但是正常的健康新生儿血清铜及铜蓝蛋白浓度也很低,通常的生物化学标志——低血清铜及血浆铜蓝蛋白浓度常不可靠。目前新生儿和胎儿中的血浆儿茶酚胺浓度异常及胎盘铜浓度(在Menkes病中增加)被认为是快速可靠的方法。随着对ATP7A基因突变位点的研究,已经可以通过PCR扩增基因测序的方法快速诊断Menkes病,为早期诊断及遗传咨询开辟了可靠的途径。目前国内已开展MENKES病基因检测,并发现了ATP7A基因两个新的突变：在第12外显子检测到不连续的碱基缺失及第15外显子碱基缺失,为进一步开展产前诊断及遗传咨询奠定了基础。我国目前积累的病例数少,尚不能提供我国Menkes病的ATP7A基因突变热点,因此应进一步积累我国的Menkes病病例,开展ATP7A基因分析,明确我国ATP7A基因的突变谱,总结中国患者ATP7A基因的突变热点。这将有助于将来在我国开展快速ATP7A基因突变检测,且能为深入研究ATP7A基因的功能特性,探讨其发病机制,探寻其新的治疗方案提供基础实时荧光定量PCR,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的,随着反应循环数的增加,最终PCR反应不再以指数方式生成模板,从而进入平台期。在传统的PCR中,常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物,因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在real-timeQ-PCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量,并且由此来推断模板最初的含量。基于以上理论,本实验旨在通过对2010年7月至2011年3月在南方医科大学珠江医院儿科诊断的3例Menkes患儿进行家系调查和临床随访,并采用分子生物学方法对3例患儿及家系成员进行确诊。PCR法扩增ATP7A基因的23个外显子及其与内含子的连接区,纯化后测序,检测基因突变情况,异常者通过实时荧光定量PCR测定模板的拷贝数,从而验证是否存在外显子的缺失。此家系的ATP7A基因突变及遗传特征进一步丰富我国Menkes病的基因突变谱。将有助于将来在我国开展快速ATP7A基因突变检测,为深入研究ATP7A基因的功能特性,探讨其发病机制,探寻其新的治疗方案奠定基础。具体内容包括以下两部分：第一部分一个X染色体隐性遗传性Menkes病家系的临床诊断及特征分析目的：2010年一位7月龄患儿因反复肺部感染来南方医科大学珠江医院儿科就诊,诊断为Menkes病,询问家族史发现该患儿家族中有类似临床表现者。为确诊该患儿为遗传性Menkes病,明确该家族的发病情况,以该家系为例探讨Menkes病的临床特点。方法：对先证者的家族成员进行家系调查,包括临床病史问诊及体检、血常规、血清铜蓝蛋白,颅脑MR检查,并绘出家系图谱。结果：本家系共10名成员,可分为A、B、C三个子家系。三个子家系均确诊1例Menkes病患者,代代相传,有性别差异,符合X染色体连锁隐性遗传。结论：一个遗传性Menkes病家系被发现和诊断,该家系发病呈X染色体隐性遗传。本家系的发病特征和国际目前认识的Menkes病特征一致。第二部分一个X染色体隐性遗传Menkes病家系的ATP7A基因的基因学检测目的：在前一部分的临床及家系调查工作基础上,结合目前公认的导致X染色体隐性遗传性Menkes病的致病基因为ATP7A,对所发现的Menkes病家系进行ATP7A基因测序,以明确本家系ATP7A基因的突变特点。方法：采集含有3位患儿的共10位家系成员及正常男性对照儿童的外周血,提取基因组DNA。根据人类基因组数据库(UCSC)中获得的ATP7A基因序列,应用引物设计软件Primer3总共设计了23对引物,覆盖了该基因23个编码外显子。根据基因测序结果,异常者通过实时荧光定量PCR测定模板的拷贝数,从而验证是否存在外显子的缺失。研究结果：1.对正常儿童及家系10人(Ⅰ代：外祖母；Ⅱ代：患儿母亲姐妹四人；Ⅲ代2例男性患儿及患儿姐姐)进行测序,3例患儿未能得到2-12外显子PCR产物条带,而同时进行扩增的其余片段均得到了PCR产物；家系中其他人均得到了PCR扩增产物,再次对患儿1和正常儿童的DNA标本进行外显子扩增,正常儿童得到了清晰的PCR产物条带,而患儿1仍无法得到PCR扩增产物。考虑3例患儿及家系成员存在ATP7A基因的2-12外显子大片段缺失。同时发现了两个已经报道的单核苷酸多态性c.4048G>A和c.2299G>C。2.采用荧光定量PCR的方法对正常儿童与家系成员缺失的2-12外显子的11个位点进行拷贝数定量检测的验证实验,结果示3例患儿及患儿外婆、母亲、姨母的2-12外显子缺失。研究结论：1、3例患儿ATP7A基因的2-12外显子大片段缺失,可明确诊断为Menkes病,另5位家系成员为Menkes病携带者。ATP7A基因的第2-12外显子缺失是本家系Menkes病的致病原因,且本家系Menkes病遗传方式符合X染色体连锁隐性遗传特点。2、发现了尚米见报道的与Menkcs病相关的ATP7A基因第2-12外显子缺失,丰富了我国Menkes病的基因突变谱；3、首次将实时定量荧光定量PCR快速、准确地运用到ATP7A基因的大片段的重复和缺失检测中,为全面探讨Menkcs病的基因诊断提供了一种全新的研究方法。主要创新点1.发现了尚未见报道的与Menkcs病相关的ATP7A基因第2-12外显子缺失,丰富了我国Menkes病的基因突变谱；2、首次将实时荧光定量PCR快速、准确地运用到ATP7A基因的大片段的重复和缺失检测中,为全面探讨Menkcs病的基因诊断提供了一种全新的研究方法。