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三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)是工业上广泛应用的一种有机溶剂,也是一种环境污染物。TCE主要通过呼吸道吸入和皮肤吸收进入人体产生职业性危害,吸收后主要蓄积于肝脏、脑、心脏等器官。体内外和动物实验证明TCE及其代谢产物可引起癌变、畸变及免疫毒性作用等。国际癌症研究署(IARC)在1995年对TCE致癌性分类做了修改,将其对人类非致癌改为―对人类可能致癌‖。SET(patient SE translocation,SET)蛋白是本课题组所确定的一个TCE致肝细胞毒性差异蛋白,它是一个重要的细胞因子,在基因表达、细胞凋亡及肿瘤发生方面的功能目前正越来越受到关注。本课题组前期通过TAP(串联亲和纯化)及质谱技术筛选出62个与SET相互作用的侯选蛋白,利用PICASSO软件进行分析,得出45个与SET具有GO共注释的蛋白质。本研究在此基础上,利用免疫共沉淀技术验证SET相互作用蛋白eEF1A1、eEF1A2,以及分析TCE作用对SET相互作用蛋白亚细胞定位和表达的影响,以探讨SET蛋白在三氯乙烯致肝细胞毒性中的作用。1、SET与eEF1A1、eEF1A2相互作用的验证:培养L-02肝细胞,用2mmol/L TCE刺激人L-02肝细胞24h后,抽提染毒组总蛋白及正常组总蛋白,用SET抗体分别沉淀SET相互作用蛋白,然后用western blotting检测洗脱下来的蛋白复合物。结果表明SET与eEF1A1、eEF1A2在人肝细胞内确实存在相互作用,且TCE刺激肝细胞24h后,结合到SET上的eEF1A1蛋白量减少,eEF1A2蛋白量增多。提示着,三氯乙烯染毒L-02肝细胞后,SET蛋白表达量升高,有可能使得TSPY与eEF1A2相互作用能力增强,从而使其蛋白质合成功能增强,为肿瘤生成提供必需条件。2、TCE作用下eEF1A1、eEF1A2蛋白肝细胞内分布变化:用2mmol/L TCE刺激人L-02肝细胞24h后,应用免疫荧光技术分别检测eEF1A1、eEF1A2蛋白在细胞内的表达和分布变化。结果表明:eEF1A1蛋白定位于细胞核、细胞质中,eEF1A2蛋白主要定位于细胞质中;与DMSO对照组相比,eEF1A2蛋白在肝细胞内的亚细胞定位发生了改变,细胞质中的部分eEF1A1蛋白转向了细胞核内。提示着,SET复合物中可能还包含eEF1A2,eEF1A2与SET结合在一起,与SET复合物一同定位于细胞质中。TCE刺激肝细胞后,包含NM23_H1在内的SET复合物转移至核内,细胞释放的粒酶A裂解SET释放DNA酶NM23_H1,激活的NM23_H1裂解染色体DNA,导致细胞凋亡。3、TCE对SET及相互作用蛋白表达的影响:分别以不同剂量的TCE刺激人L-02肝细胞24h后,抽提蛋白,进行western blotting检测。结果显示,随着染毒剂量的增加,eEF1A1、eEF1A2、CAPZB、SET的表达与溶剂对照组比较呈先下降后增高的趋势,DDB1呈先增高后下降的趋势。提示,低剂量的TCE刺激肝细胞时,会增加修复性蛋白DDB1的表达,以及抑制与肿瘤发生相关的蛋白eEF1A1、eEF1A2、CAPZB、SET的表达,产生兴奋效应,有利于细胞生长;高剂量的TCE刺激肝细胞后,机体有限的补偿不能抵消损害时,则降低DDB1的表达,增加eEF1A1、eEF1A2、CAPZB、SET的表达,对机体造成损伤。据我们所知,本研究是首次利用蛋白质组学技术来分析SET在三氯乙烯肝细胞毒性中的蛋白质相互作用及其影响。在文中所做的详细的蛋白质组学分析,将有助于进一步阐明SET蛋白在三氯乙烯致肝细胞毒性中的作用及其机制。