论文部分内容阅读
猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)是目前危害全球养猪业重要病原之一。研究病毒编码蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用对于理解PRRSV的致病机制具有十分重要的意义。本研究在筛选、鉴定与PRRSV非结构蛋白11和12(Nsp11、Nsp12)相互作用宿主蛋白的基础上,进一步选取Galectin-1和Galectin-3为研究目标,分析了其分别与Nsp11、Nsp12发生相互作用的生物学意义,以期为阐明PRRSV的致病机制提供科学依据。分别将含有PRRSV Nsp11和Nsp12基因的酵母质粒pGBKT7转化酵母菌Y2H Gold进行细胞毒性和自激活实验,结果表明,Nsp1 1和Nsp12基因编码的蛋白无细胞毒性和自激活现象。应用猪肺泡巨噬细胞(PAM)cDNA文库和酵母双杂交技术,分别筛选与Nsp11、Nsp12相互作用的细胞蛋白,将阳性克隆进行质粒提取和测序分析,并在NCBI上进行序列比对,确定相应序列对应的基因和相互作用的候选蛋白。利用酵母回复杂交和免疫共沉淀试验证实Nsp11与Galectin-1、Nsp12与Galectin-3之间存在相互作用。将编码猪Galectin-1、Galectin-3的基因序列分别克隆入真核载体PCAGGS。过表达Galectin-1、Galectin-3可显著抑制不同毒力、不同基因型PRRSV毒株在MARC-145细胞上的复制,且Galectin-1的抑制作用更加强烈。进一步研究发现,将原核表达的Galectin-1蛋白孵育MARC-145细胞,也可引起PRRSV复制的显著抑制,且作用的强弱与Galectin-1蛋白浓度在一定范围内呈正相关。为探讨Galectin-1是否具有广泛的抗病毒作用,过表达Galectin-1后分别感染马动脉炎病毒、伪狂犬病毒(PRV)、流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)和乙型脑炎病毒(JEV),结果显示,过表达Galectin-1对PRV、PEDV、CSFV、JEV的复制呈不同程度的抑制,提示Galectin-1的广谱抗病毒作用。