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目的建立同时测定大鼠血浆中丹参素、原儿茶酸、香草酸、丹酚酸B和羟基红花黄色素A(HYSA)质量浓度的HPLC-DAD方法,采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,研究丹红注射液主要有效成分正交配伍的药代动力学特征,并在此基础上建立基于丹红注射液有效成分抗炎作用的PK-PD结合模型,为中药复方配伍的药动学与药效学研究提供思路和参考。方法(1)MCAO模型制作:采用改良的线栓法制作大鼠MCAO模型,不分离结扎翼腭动脉,从血管分叉处插入栓线至大脑中动脉,缺血1h后拔线栓实现再灌注,于再灌注24 h时进行神经功能评分,TTC染色观察脑梗死状况,HE染色观察脑组织病理学改变。(2)建立HPLC-DAD测定方法:脑缺血再灌注大鼠经尾静脉注射丹红注射液主要有效成分丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B和HYSA后眼眶取血,血样预处理后,采用Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱以乙腈-0.4%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。检测波长280 nm用于检测丹参素、原儿茶酸、香草酸和丹酚酸B,403 nm用于检测HYSA,柱温为30℃,内标法定量。(3)药动学研究:采用正交试验法L9(34)组成丹红注射液主要有效成分(丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、HYSA)用量配比不同的9个组方,供大鼠尾静脉给药,进行药动学研究。用DAS 3.2.6软件以非房室模型拟合药动学参数,并运用总量统计矩法对整体药动学特征进行评价。(4)PK-PD结合模型研究:选取(3)中组方6静脉注射给药,以TNF-α和IL-1β为药效指标,同步进行药动学与药效学研究,以DAS 3.2.6软件进行PK-PD结合模型的拟合,获得各药物浓度与药效之间的定量方程。结果(1)成功的建立了大鼠局灶性脑缺血再灌注模型:大鼠脑缺血1 h再灌24 h后,出现明显的神经功能缺失症状,平均评分结果为2.83±0.75。TTC染色结果显示,假手术组脑组织染为均匀的红色,模型组大鼠脑组织缺血侧半球大部分呈现明显的苍白色。HE染色结果显示,假手术组脑组织无病理性损伤,细胞形态完整,排列规则,而模型组大鼠脑组织缺血侧细胞排列紊乱,界线模糊,神经细胞核固缩,出现三角致密核,核深染,脑组织内水肿、疏松化,出现大量空泡,胞浆嗜酸性明显增多。(2)成功的建立了丹红注射液中主要有效成分(丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B和HYSA)及其在脑缺血(MCAO)大鼠体内代谢产物(原儿茶酸、香草酸)的定性定量分析方法。丹参素、原儿茶酸、香草酸、丹酚酸B和HYSA的进样浓度分别在0.35～140mg·L-1(R2=0.999 8),0.15～60mg.L-1(R2=0.9990),0.05～20 mg.L-1(R2=0.9988),0.25～100 mg·L-1(R2=0.999 6),0.075～30 mg·L-1(R2=0.998 5)范围内呈良好的线性关系,平均回收率均在85%～1 15%之间,日内、日间RSD均小于10%,稳定性符合体内药物分析要求。(3)正交配伍药代动力学结果表明:丹红注射液主要有效成分丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B和HYSA正交配伍给药后,在脑缺血再灌注大鼠体内的药动学特征有所差异。总量统计矩研究表明不同配伍对总量统计矩各参数影响不一,总量零阶矩AUCt以丹参素水平影响最大,且影响显著(P<0.05),最优组合为A3B3C2D1;总量一阶矩MRT,以HYSA水平影响最大,最优组合为A1B3C1D1。(4)PK-PD研究表明:丹红注射液主要有效成分给药干涉后,一定程度上会抑制脑缺血再灌注大鼠血浆中炎症因子TNF-α和IL-1β的升高,药物效应与药物血药浓度之间存在明显的滞后现象,各PK-PD模型均符合Sigmoid Emax模型,拟合结果与实测数据之间相关性良好,P值均小于0.05。结论(1)改良线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,操作相对简单易行可控,成功率较高,可为后期进行药动学与药效学研究提供稳定、可靠的疾病动物模型。(2)所建立的HPLC-DAD测定方法专属性强,分离度好,分析时长适宜,操作简单快速,可用于MCAO大鼠体内丹参素、原儿茶酸、香草酸、丹酚酸B、羟基红花色素A含量的同时测定及其药代动力学研究。(3)丹红注射液主要有效成分配伍对各自在MCAO大鼠体内的药动学行为具有一定影响;总量统计矩可整合多成分的药代动力学参数,表达各组方的整体药代动力学行为,中药复方多成分药物代谢动力学可采用总量统计矩法进行研究。(4)丹红注射液抗脑缺血再灌注损伤可能与其有效成分的抗炎特性有关,PK-PD结合模型可用于中药复方多成分药动学与药效学之间相关性的评价与预测。